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當(dāng)前位置:上海尚寶生物科技有限公司>>試劑盒>>生化試劑盒>> BA1253-100羥脯氨酸(HYP)含量檢測試劑盒(微量法)
BA1253-100
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上海市
更新時間:2021-11-22 15:38:48瀏覽次數(shù):224次
聯(lián)系我時,請告知來自 化工儀器網(wǎng)供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100管/96樣 |
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貨號 | BA1253-100 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
注意:正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。
產(chǎn)品貨號:BA1253
產(chǎn)品規(guī)格:100管/96樣
產(chǎn)品簡介:
HYP是機體膠原蛋白主要成分之一,膠原蛋白大多分布于皮膚、腱、軟骨和血管等,因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項重要指標(biāo)。
樣品經(jīng)酸水解產(chǎn)生游離的HYP,進一步被氯胺T氧化,氧化產(chǎn)物與對二甲氨基甲醛反應(yīng),產(chǎn)生紅色化合物,在560nm處有特征吸收峰。通過測定樣品水解液560nm吸光值,可計算HYP含量。
產(chǎn)品內(nèi)容:
提取液:6mol/L鹽酸,自備。濃鹽酸:H2O(V/V)= 1:1,室溫保存。
試劑一:液體8mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑二:液體8mL×1瓶,4℃避光保存。
標(biāo)準(zhǔn)品:液體0.5mL×1支,0.5mg/mL羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,4℃保存。
需自備的儀器和用品:
天平、烘箱、玻璃管、離心機、水浴鍋、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、6mol/L鹽酸和蒸餾水。
操作步驟:
一、羥脯氨酸提?。?/span>
1、組織:稱取約0.2g樣品于玻璃管,將組織盡量剪碎以便消化,蓋子稍松不密閉。加入2mL的提取液,煮沸或110℃烘箱2至6小時消化至沒有可見大的團塊,16000rpm,25℃,離心20min(若離心后仍有雜質(zhì),可通過過濾去除),用10mol/LNaOH(約1mL)調(diào)節(jié)pH值至6~8范圍內(nèi)。蒸餾水定容至4mL,取上清待測。(過程中可能有黑色物質(zhì)生成,若長時間不能消化,可能為碳化的物質(zhì))
2、細胞:取500萬個細胞,加入1mL的提取液,煮沸或110℃烘箱2至6小時消化至透明狀,16000rpm,25℃,離心20min,用10mol/LNaOH(約0.5mL)調(diào)節(jié)pH值至6~8范圍內(nèi)。蒸餾水定容至2mL,取上清待測。
二、測定步驟:
1、將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234µg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2、分光光度計預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至560nm,蒸餾水調(diào)零。
3、按下表進行操作:
空白管 | 測定管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | |
樣品(μL) | 60 | ||
標(biāo)準(zhǔn)溶液(μL) | 60 | ||
試劑一(μL) | 60 | 60 | 60 |
混勻,室溫靜置20min | |||
試劑二(μL) | 60 | 60 | 60 |
H2O(μL) | 180 | 120 | 120 |
混勻,60℃,20min水浴,取出后室溫靜置15min,取200µL于微量玻璃比色皿/96 孔板中檢測 A560吸光值。ΔA=A測定管-A空白管 |
三、羥脯氨酸含量計算公式
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:
以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸,?A標(biāo)準(zhǔn)(?A =A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)為y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到方程y=kx+b。將?A測定(?A =A測定管-A空白管)帶入方程得到x。
2、羥脯氨酸含量的測定:
(1)按樣本鮮重計算:
組織羥脯氨酸含量(µg/g鮮重)= x×V樣品÷(W×V樣品÷V組提)=4x÷W
(2)按樣本蛋白濃度計算:
組織羥脯氨酸含量(µg/mg prot)= x×V樣品÷(Cpr×V樣品)=x÷Cpr
(3)按細菌或細胞數(shù)量計算:
細胞羥脯氨酸含量(µg/104cell)= x×V樣品÷(細胞數(shù)量×V樣品÷V胞提)=2x÷細胞數(shù)量
V樣品:加入的樣品體積,0.06mL;V組提:組織提取液體積,4mL;V胞提:細胞提取液體積,2mL;W:樣本鮮重,g;細胞數(shù)量:以104為單位,萬個;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL。
注意事項:
1、OD值大于1.0,樣品適當(dāng)稀釋再測定,注意計算公式里乘以稀釋倍數(shù)。
2、試劑有一定的毒性,請操作時做好防護措施,防止吸入或與皮膚接觸。
3、按樣本蛋白濃度計算時,需單獨提取樣本中的蛋白質(zhì)并測定。
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