一步法感受態(tài)細菌制備試劑盒 

產(chǎn)品貨號：11127 

產(chǎn)品規(guī)格：100T/500T 

產(chǎn)品簡介：

一步法感受態(tài)細菌制備試劑盒(One Step Competent Cell Preparation Kit) 是一種用于大腸桿菌感受態(tài)細菌快速制備的試劑盒。是在經(jīng)典的TSS法的基礎(chǔ)上進行適當改良而成，既繼承了TSS法的快速和簡便，又在此基礎(chǔ)上提高了感受態(tài)細菌的轉(zhuǎn)化效率和易操作性。使用本試劑盒可以使感受態(tài)效率達到106以上。不僅可以轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，而且可以轉(zhuǎn)化普通的連接產(chǎn)物。另外，對細菌的培養(yǎng)條件要求比較寬松，培養(yǎng)的細菌只要處于對數(shù)期內(nèi)就可以使用本試劑盒制備感受態(tài)細菌。使用本試劑盒操作非常簡單，細菌培養(yǎng)好后僅需十幾分鐘就可以完成感受態(tài)細菌的制備。本試劑盒適用于絕大部分常見的大腸桿菌，包括DH5α、JM109、TG1、HB101和XL-1等。對于一些用于蛋白表達或病毒質(zhì)粒構(gòu)建的特殊大腸桿菌也適用，制備出來的感受態(tài)菌轉(zhuǎn)化質(zhì)?？隙]有問題，但如果轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物有時效果不如DH5α等其它常見的細菌。本試劑盒提供了DH5α甘油菌作為菌種，可以用于制備感受態(tài)細菌。本試劑盒可以分多次使用，共可以制備足夠進行200-400次轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細菌。 

產(chǎn)品組成：試劑名稱 100T 500T感受態(tài)制備試劑 5ml 25mlDH5α甘油菌 100μl 500μl 

使用說明：

 1. 涂平板： 

為取得最佳的感受態(tài)效率，必須先把甘油菌或其它形式保存的菌種涂 LB 平板，并培養(yǎng)過夜。

 2. 接種：

 取一有新鮮培養(yǎng)的菌種的 LB 平板，后續(xù)操作均在超凈臺內(nèi)進行。把鑷子的頂端在 70%酒精中蘸一下，并在酒精燈上略略燒一下，使鑷子的頂端處于無菌狀態(tài)。用鑷子夾取一個無菌的塑料槍頭或牙簽，從平板上挑取一個單克隆，然后把蘸有菌種的塑料槍頭或牙簽放到裝有 3 毫升 LB 的細菌培養(yǎng)試管內(nèi)。上述操作也可以使用接種環(huán)等進行操作。 

3. 培養(yǎng)： 

37℃約 200rpm 培養(yǎng)過夜，通常培養(yǎng)時間控制在 16 小時左右為宜。絕對不宜超過 18 小時。

 4. 再接種培養(yǎng)：

 根據(jù)需要制備的感受態(tài)細菌的量，按照 1:100 的比例用新鮮培養(yǎng)的過夜菌接種培養(yǎng)。例如取 500 微升的新鮮過夜菌到 50 毫升的 LB 中繼續(xù) 37℃約 200rpm 培養(yǎng)。通常在大約培養(yǎng) 2-2.5 小時后 OD600 可以達到 0.3-0.5。 

5. 制備感受態(tài)細菌： 

在培養(yǎng)的細菌 OD600 達到 0.3-0.5 時，4℃2000g 離心 5 分鐘收集細菌。 如果離心沉淀前的菌量為 50 毫升，按后續(xù)操作進行，如果是其它體積則按比例換算后進行后續(xù)操作。用 5 毫升預(yù)冷的 LB 重新懸浮起細菌沉淀，加入 5毫升在冰浴或冰水浴上融解的感受態(tài)制備試劑，混勻，冰浴放置 5 分鐘。然后再輕輕混勻，根據(jù)實驗需要適當分裝到 1.5 毫升或 0.5 毫升的離心管內(nèi)后-70℃保存。注：如果以后會只做單管的轉(zhuǎn)化，可以分裝成每管最少 50 微升或 100 微升，如果以后一次性做多個轉(zhuǎn)化，可以每管分裝 500 微升或更大體積。-70℃保存后，感受態(tài)的效率會隨時間的推移逐漸下降，但通常在半年內(nèi)使用轉(zhuǎn)化效率下降不會太多?？偟膩碚f，新鮮制備的感受態(tài)要比凍存的感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率更高一些。 

6. 感受態(tài)細菌的使用：

 a.對于感受態(tài)細菌效率的測定或連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化(其它如基因突變產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化等參考連接產(chǎn)物進行)：

 (a)在冰上緩慢融解感受態(tài)細菌(對于新鮮制備的感受態(tài)就可以直接使用了)，如果檢測感受態(tài)細菌的效率，加入100pg-10ng 質(zhì)粒，但質(zhì)粒的體積不宜超過感受態(tài)細菌量的 10%。如果轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，每 100 微升感受態(tài)細菌加入10 微升連接產(chǎn)物。

 (b)輕輕用手指彈動離心管，以混勻細菌和質(zhì)粒或連接產(chǎn)物。冰浴或冰水浴放置 30 分鐘。

 (c)42℃水浴，熱休克 2 分鐘。 

(d)熱休克后立即置于冰水浴中，2 分鐘。 

(e)加入 900 微升 LB，37℃200rpm 培養(yǎng) 1 小時。(f)如果檢測感受態(tài)效率，取 100 微升涂布到含有相應(yīng)抗生素的 LB 平板上。如果轉(zhuǎn)化的是連接產(chǎn)物，2000-3000g離心 1 分鐘或更長時間使細菌充分沉淀下來。去除約 900-950 微升 LB 培養(yǎng)液。細菌沉淀用余下的 LB 培養(yǎng)液重懸，然后全部涂布到含有適當抗生素的 LB 平板上。37℃培養(yǎng)過夜。 

b.對于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：

 (a)融解感受態(tài)細菌，加入不少于 50ng 質(zhì)粒到 50 或 100 微升感受態(tài)細菌中。質(zhì)粒的量可以是 1 微克或更多，但體積不宜超過感受態(tài)細菌量的 10%。

 (b)輕輕用手指彈動離心管，以混勻細菌和質(zhì)粒。冰浴或冰水浴放置 10 分鐘。

 (c)取全部菌液直接涂布到含有適當抗生素的 LB 平板上，37℃培養(yǎng)過夜。

 注意事項：

 需自行配制 LB 液體培養(yǎng)基和 LB 平板以用于細菌的培養(yǎng)和感受態(tài)效率的檢測。盡管經(jīng)過我們的測試凡是處于對數(shù)期內(nèi)的細菌都可以用于感受態(tài)細菌的制備，但如果細菌生長的 OD600 的值達到 0.3-0.5 左右時，制備出來的感受態(tài)效果較佳。在制備感受態(tài)細菌的過程中均使用不含抗生素的 LB。在使用感受態(tài)菌的過程中熱休克后的 37℃培養(yǎng)時也必須使用無抗生素的 LB，即便轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒是有抗性的。本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

 有效期：-20℃保存，一年有效。