磷酸果糖激酶（PFK）活性檢測試劑盒（紫外分光光度法）

產(chǎn)品貨號：BA1194

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品簡介：

PFK（EC 2.7.1.11）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，負(fù)責(zé)將果糖-6-磷酸和ATP轉(zhuǎn)化為果糖-1,6 二磷酸和ADP，是糖酵解過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PFK活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進(jìn)行檢測。

產(chǎn)品內(nèi)容：

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入2.8mL雙蒸水充分溶解備用；-20℃分裝保存一周；

2. 試劑三：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中。臨用前根據(jù)用量按照試劑三:蒸餾水為2:13 的體積比例充分混勻， 現(xiàn)用現(xiàn)配；用不完的試劑三原液建議-20℃分裝保存，避免反復(fù)凍融；

3. 試劑四：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中。臨用前根據(jù)用量按照試劑四:蒸餾水為4:65的體積比例充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配； PFK工作液（可測25個樣）的配制：取19mL試劑一和1.26mL試劑二充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本的前處理 

1. 細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備

細(xì)菌或細(xì)胞處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織處理：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 血清（漿）樣品：直接檢測。

二、測定步驟

1. 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 操作表

將上述試劑按順序加入1mL石英比色皿中，加樣本的同時開始計時；在340nm波長下記錄20秒時的初始吸光度A1，比色后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘；迅速取出比色皿并擦干，340nm下比色，記錄10分20秒時的吸光度A2，計算?A=A1-A2。

三、PFK活力單位的計算：

1. 血清（漿）PFK活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（U/mL）=[△A×V反總÷（ε×d）×10⁹ ] ÷V樣÷T=450×△A

2. 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PFK活力的計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（U/mg prot）＝[△A×V反總÷（ε×d）×10⁹ ] ÷(Cpr×V樣)÷T=450×△A ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（U/g 鮮重）＝[△A×V反總÷（ε×d）×10⁹ ] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T=450×△A ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（U/10⁴ cell）＝[△A×V反總÷（ε×d）×10⁹ ] ÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.9×△A

V反總：反應(yīng)體系總體積，8.4×10^-4L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，10min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

注意事項：

1. 測定過程中試劑三、試劑四和樣本在冰上放置，以免變性和失活。

2. 比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

3. 最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4. 若?A大于0.5，需將酶液用酶提取液稀釋，使?A小于0.5，可提高檢測靈敏度。