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β-木糖苷酶活性檢測試劑盒(微量法)
產(chǎn)品貨號:BA1028
產(chǎn)品規(guī)格:100管/48樣
產(chǎn)品內(nèi)容:
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體100mL×1瓶 | 4℃ |
試劑一 | 粉劑×1支 | -20℃ |
試劑二 | 液體15mL×1瓶 | 4℃ |
試劑三 | 液體15mL×1瓶 | 4℃ |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 液體1mL×1瓶 | 4℃ |
溶液的配制:
1. 試劑一:臨用前加入1mL蒸餾水。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品:5μmol/mL對硝基苯酚溶液。
產(chǎn)品說明:
β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、細(xì)菌和真菌等生物體,是催化木聚糖類半纖維素降解的關(guān)鍵酶,產(chǎn)物木糖可作為碳源應(yīng)用于微生物發(fā)酵。另外,β-木糖苷酶還可以作為生物漂白劑應(yīng)用于造紙工業(yè),比傳統(tǒng)的漂白法環(huán)保,具有廣泛的應(yīng)用價值。
β-木糖苷酶催化對硝基苯酚-β-D-木糖苷產(chǎn)生對硝基苯酚,對硝基苯酚在405nm處有特征吸收峰, 測定405nm光吸收增加速率,可計算β-木糖苷酶活性。
注意:實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品:
天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、水浴鍋、蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)
1. 植物樣本:稱取約0.1g樣品,加1.0 mL提取液充分冰浴勻漿,然后12000rpm,4℃,離心20min,棄沉淀,取20μL上清測定蛋白含量,剩余上清作為待測酶液。
2. 細(xì)菌、真菌樣本:收集約500萬個細(xì)胞,加入1.0 mL提取液,超聲波破碎(冰浴,功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000rpm,4℃,離心10min,棄沉淀 ,取20μL上清測定蛋白含量,剩余上清置于冰上待測。
二、測定操作表
1. 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至405nm,對照管調(diào)零。
2. 標(biāo)準(zhǔn)液的處理:用試劑二將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μmol/mL。
3. 樣本測定:
試劑名稱(μL) | 對照管 | 測定管 | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 |
酶液 | 40 | 40 | ||
標(biāo)準(zhǔn)品 | 40 | |||
試劑一 | 10 | |||
試劑二(μL) | 80 | 70 | 120 | 80 |
混勻,45℃水浴20min | ||||
試劑三(μL) | 80 | 80 | 80 | 80 |
混勻,靜置5min,微量玻璃比色皿/96孔板,測定405nm吸光值,分別記為A對照、A測定、A空白、A標(biāo)準(zhǔn)。并計算ΔA測定= A測定- A對照、ΔA標(biāo)準(zhǔn)= A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。 |
三、β-木糖苷酶活性計算
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)(x)和濃度(y,μmol/mL)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,將ΔA測定帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,計算樣本生成的產(chǎn)物量y(μmol/mL)。
1. 按樣本蛋白含量計算:
酶活定義:45℃,pH7.4時,每毫克蛋白質(zhì)1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。
β-木糖苷酶活性(U/ mg prot)=(y×V樣)÷(V樣×Cpr)÷T=0.05×y÷Cpr
2. 按樣本質(zhì)量計算:
酶活定義:45℃,pH7.4時,每克樣本1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。
β-木糖苷酶活性(U/g 質(zhì)量)=(y×V樣)÷(W×V樣÷V樣總)÷T=0.05×y÷W
3. 按細(xì)胞數(shù)量計算:
酶活定義:45℃,pH7.4時,每104個細(xì)胞1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。
β-木糖苷酶活性(U /104cell)= (y×V樣)÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.0001×y
Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;0.2mL;V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.04mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬;T:反應(yīng)時間,20min。
注意事項:
1. 吸光度變化應(yīng)該控制在0.05-0.6之間。否則加大樣品量或稀釋樣品,注意計算公式中參與計算的稀釋倍數(shù)要相應(yīng)改變。
2. 樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測定,可選用考馬斯亮藍(lán)法蛋白含量測定試劑盒進行測定。
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