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乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(二硝基苯肼微板法)
產(chǎn)品貨號(hào):BA1696
產(chǎn)品規(guī)格:50T/100T
產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH或LD)屬于氧化還原酶,能夠催化氫氧原子或電子從一種底物轉(zhuǎn)移到另一種底物上乳酸脫氫酶是糖酵解和糖異生的一個(gè)極其重要的酶,含有鋅離子,廣泛分布于人和動(dòng)物組織、植物和微生物,能可逆的催化乳酸 (L)和丙酮酸(P)之間的氧化還原反應(yīng)。其反應(yīng)公式:乳酸+NAD + →丙酮酸+NADH + H 。其中:L→P為正向反應(yīng);P→L為逆向反應(yīng)。
乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(二硝基苯肼微板法)其檢測(cè)原理是以NAD為受氫體,乳酸脫氫酶催化乳酸脫氫生成丙酮酸,丙酮酸與二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙,后者在堿性溶液中呈棕紅色,顏色深淺與丙酮酸濃度呈正比,酶標(biāo)儀檢測(cè)440nm處吸光度,通過(guò)測(cè)得的丙酮酸含量計(jì)算酶的活性。該方法的優(yōu)點(diǎn)是:1、試劑原料容易獲得;2、較為經(jīng)典的方法;3、適用于手工操作。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域,不宜用于臨床診斷或其他用途。
產(chǎn)品組成:
試劑名稱 | 50T | 100T | 保存條件 |
試劑(A): 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)(50mmol/L) | 1ml | 1ml | 2-8℃,避光 |
試劑(B): LDH Assay buffer | 3ml | 6ml | 2-8℃,避光 |
試劑(C): NAD Buffer | 0.3ml | 0.5ml | -20℃ |
試劑(D): 二硝基苯肼溶液 | 1.5ml | 3ml | 2-8℃,避光 |
試劑(E): 堿性顯色液 | 5ml | 10ml | 室溫 |
自備材料:
1. 蒸餾水
2. 離心管
3. 恒溫箱或水浴鍋
4. 酶標(biāo)儀、96孔板
操作步驟:
1. 準(zhǔn)備樣品:
①血漿、血清樣品:血漿、血清按照常規(guī)方法制備,10倍稀釋后可以用于本試劑盒的測(cè)定,室溫保存3天,用于LDH的檢測(cè)。
②細(xì)胞或組織樣品:取恰當(dāng)細(xì)胞或組織進(jìn)行勻漿,低速離心取上清,室溫保存3天,用于LDH的檢測(cè)。
③(選做)樣品準(zhǔn)備完畢后可以用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度,以便于后續(xù)計(jì)算單位蛋白重量組織或細(xì)胞內(nèi)的LDH含量。
2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品:用LDH Assay buffer準(zhǔn)確稀釋丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)(5mmol/L)至0.5mmol/L,按下表稀釋系列標(biāo)準(zhǔn)品。
加入物(ml) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)(0.5mmol/L) | 0.0125 | 0.025 | 0.05 | 0.075 | 0.1 |
LDH Assay buffer | 0.2375 | 0.225 | 0.2 | 0.175 | 0.15 |
相當(dāng)于LDH活力(金氏)單位(U) | 125 | 250 | 500 | 750 | 1000 |
3. 配制堿性顯色工作液:按堿性顯色液:蒸餾水=2:3的比例混合,即為堿性顯色工作液。
4. LDH酶促:按照下表設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)孔、對(duì)照孔、測(cè)定孔,溶液應(yīng)按照順序依次加入,并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中酶活性過(guò)高,可減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再行測(cè)定。
加入物(μl) | 空白孔 | 標(biāo)準(zhǔn)孔 | 對(duì)照孔 | 測(cè)定孔 |
蒸餾水 | 10 | 10 | 5 | - |
系列丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)(1~5號(hào)) | - | 25 | - | - |
待測(cè)樣品(如血清等) | - | - | 5 | 5 |
LDH Assay buffer | 25 | - | 25 | 25 |
混勻,37℃孵育5min。 | ||||
NAD Buffer | - | - | - | 5 |
混勻,37℃孵育15min,空白和標(biāo)準(zhǔn)無(wú)須37℃孵育。 | ||||
二硝基苯肼溶液 | 25 | 25 | 25 | 25 |
混勻,37℃孵育15min。 | ||||
堿性顯色工作液 | 250 | 250 | 250 | 250 |
5. LDH測(cè)定:混勻,室溫放置5min,酶標(biāo)儀440nm處測(cè)定各孔吸光度(記為A空白、A標(biāo)準(zhǔn)、A對(duì)照、A測(cè)定 )。
計(jì)算:
LDH活性單位的定義:以100ml血清,在37℃孵育15min, LDH催化底物產(chǎn)生1μmol丙酮酸為一個(gè)金氏酶活力單位。根據(jù)酶活性定義,計(jì)算出樣品中的LDH活性。
以LDH活力(金氏)單位(U)為橫坐標(biāo),以(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白 )吸光度之差值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,用(A測(cè)定-A對(duì)照 )吸光度之差值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)樣品的LDH酶活力單位。
其中:A標(biāo)準(zhǔn)=標(biāo)準(zhǔn)孔的吸光度
A空白=空白孔的吸光度
A測(cè)定=測(cè)定孔的吸光度
A對(duì)照=對(duì)照孔的吸光度
注意事項(xiàng):
1. 血清或肝素抗凝血漿檢測(cè)效果較好,草酸鹽、EDTA抗凝劑對(duì)LDH活性有抑制作用。
2. 避免使用溶血樣本。處理后的樣品應(yīng)及時(shí)檢測(cè),否則易失效。
3. LD4和LD5對(duì)冷不穩(wěn)定,提取出來(lái)的血清樣本,不宜冰箱放置,室溫放置2~3天有效。
4. 比色應(yīng)在3~15min內(nèi)完成,否則吸光度會(huì)下降。
5. 酶促反應(yīng)中,組織勻漿液取樣量為5~30ul,應(yīng)相應(yīng)增加空白和標(biāo)準(zhǔn)中蒸餾水的用量。
6. 如果樣品中酶活性過(guò)高,可減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再行測(cè)定。
7. 堿性顯色液有一定腐蝕性,請(qǐng)小心操作。
8. 為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
有效期: 6個(gè)月有效。
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