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乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(二硝基苯肼微板法)

時(shí)間:2022/11/18閱讀:304
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乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(二硝基苯肼微板法)

產(chǎn)品貨號:BA1696

產(chǎn)品規(guī)格:50T/100T

產(chǎn)品簡介:

乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenaseLDHLD)屬于氧化還原酶,能夠催化氫氧原子或電子從一種底物轉(zhuǎn)移到另一種底物上乳酸脫氫酶是糖酵解和糖異生的一個(gè)極其重要的酶,含有鋅離子,廣泛分布于人和動(dòng)物組織、植物和微生物,能可逆的催化乳酸 (L)和丙酮酸(P)之間的氧化還原反應(yīng)。其反應(yīng)公式:乳酸+NAD + →丙酮酸+NADH + H 。其中:L→P為正向反應(yīng);P→L為逆向反應(yīng)。

乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(二硝基苯肼微板法)其檢測原理是以NAD為受氫體,乳酸脫氫酶催化乳酸脫氫生成丙酮酸,丙酮酸與二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙,后者在堿性溶液中呈棕紅色,顏色深淺與丙酮酸濃度呈正比,酶標(biāo)儀檢測440nm處吸光度,通過測得的丙酮酸含量計(jì)算酶的活性。該方法的優(yōu)點(diǎn)是:1、試劑原料容易獲得;2、較為經(jīng)典的方法;3、適用于手工操作。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域,不宜用于臨床診斷或其他用途。

產(chǎn)品組成:

試劑名稱

50T

100T

保存條件

試劑(A): 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)(50mmol/L)

1ml

1ml

2-8℃,避光

試劑(B): LDH Assay buffer

3ml

6ml

2-8℃,避光

試劑(C): NAD Buffer

0.3ml

0.5ml

-20

試劑(D): 二硝基苯肼溶液

1.5ml

3ml

2-8℃,避光

試劑(E): 堿性顯色液

5ml

10ml

室溫

自備材料:

1. 蒸餾水

2. 離心管

3. 恒溫箱或水浴鍋

4. 酶標(biāo)儀、96孔板

操作步驟:

1. 準(zhǔn)備樣品:

①血漿、血清樣品:血漿、血清按照常規(guī)方法制備,10倍稀釋后可以用于本試劑盒的測定,室溫保存3天,用于LDH的檢測。

②細(xì)胞或組織樣品:取恰當(dāng)細(xì)胞或組織進(jìn)行勻漿,低速離心取上清,室溫保存3天,用于LDH的檢測。

(選做)樣品準(zhǔn)備完畢后可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,以便于后續(xù)計(jì)算單位蛋白重量組織或細(xì)胞內(nèi)的LDH含量。

2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品:用LDH Assay buffer準(zhǔn)確稀釋丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)(5mmol/L)0.5mmol/L,按下表稀釋系列標(biāo)準(zhǔn)品。

加入物(ml

1

2

3

4

5

丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)(0.5mmol/L)

0.0125

0.025

0.05

0.075

0.1

LDH Assay buffer

0.2375

0.225

0.2

0.175

0.15

相當(dāng)于LDH活力(金氏)單位(U)

125

250

500

750

1000

3. 配制堿性顯色工作液:按堿性顯色液:蒸餾水=2:3的比例混合,即為堿性顯色工作液。

4. LDH酶促:按照下表設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)孔、對照孔、測定孔,溶液應(yīng)按照順序依次加入,并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中酶活性過高,可減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再行測定。

加入物(μl)

空白孔

標(biāo)準(zhǔn)孔

對照孔

測定孔

蒸餾水

10

10

5

-

系列丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)(1~5)

-

25

-

-

待測樣品(如血清等)

-

-

5

5

LDH Assay buffer

25

-

25

25

混勻,37℃孵育5min

NAD Buffer

-

-

-

5

混勻,37℃孵育15min,空白和標(biāo)準(zhǔn)無須37℃孵育。

二硝基苯肼溶液

25

25

25

25

混勻,37℃孵育15min

堿性顯色工作液

250

250

250

250

5. LDH測定:混勻,室溫放置5min,酶標(biāo)儀440nm處測定各孔吸光度(記為A空白、A標(biāo)準(zhǔn)、A對照、A測定 )。

計(jì)算:

LDH活性單位的定義:以100ml血清,在37℃孵育15min, LDH催化底物產(chǎn)生1μmol丙酮酸為一個(gè)金氏酶活力單位。根據(jù)酶活性定義,計(jì)算出樣品中的LDH活性。

LDH活力(金氏)單位(U)為橫坐標(biāo),以(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白 )吸光度之差值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,用(A測定-A對照 )吸光度之差值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測樣品的LDH酶活力單位。

其中:A標(biāo)準(zhǔn)=標(biāo)準(zhǔn)孔的吸光度

A空白=空白孔的吸光度

A測定=測定孔的吸光度

A對照=對照孔的吸光度

注意事項(xiàng):

1. 血清或肝素抗凝血漿檢測效果較好,草酸鹽、EDTA抗凝劑對LDH活性有抑制作用。

2. 避免使用溶血樣本。處理后的樣品應(yīng)及時(shí)檢測,否則易失效。

3. LD4LD5對冷不穩(wěn)定,提取出來的血清樣本,不宜冰箱放置,室溫放置2~3天有效。

4. 比色應(yīng)在3~15min內(nèi)完成,否則吸光度會下降。

5. 酶促反應(yīng)中,組織勻漿液取樣量為5~30ul,應(yīng)相應(yīng)增加空白和標(biāo)準(zhǔn)中蒸餾水的用量。

6. 如果樣品中酶活性過高,可減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再行測定。

7. 堿性顯色液有一定腐蝕性,請小心操作。

8. 為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

有效期 6個(gè)月有效。


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