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技術(shù)傳授:
凍存培養(yǎng)基
凍存細(xì)胞時必須使用推薦的凍存培養(yǎng)基。凍存培養(yǎng)基中應(yīng)含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護劑。還可使用專門配制的*凍存培養(yǎng)基。
1）細(xì)胞凍存培養(yǎng)基是一種用于哺乳動物細(xì)胞的即用型*凍存培養(yǎng)基，其所含胎牛血清和牛血清比例經(jīng)過優(yōu)化，可改善細(xì)胞活力以及解凍后的細(xì)胞復(fù)蘇效果。 
2）凍存培養(yǎng)基是一種化學(xué)成分確定的、無蛋白、無菌凍存培養(yǎng)基，含10% DMSO，適用于多種干細(xì)胞和原代細(xì)胞 (黑色素細(xì)胞除外) 的凍存。
培養(yǎng)細(xì)胞凍存方案
以下實驗方案介紹了培養(yǎng)細(xì)胞凍存的一般流程。詳細(xì)的實驗方案，必須參閱針對具體細(xì)胞的產(chǎn)品說明書。 
1.配制凍存培養(yǎng)基，于2°C至8°C下儲存，直至使用。請注意使用何種凍存培養(yǎng)基取決于所用細(xì)胞系。
2.凍存貼壁細(xì)胞時，利用傳代時所用方法輕柔地使細(xì)胞從組織培養(yǎng)容器上脫離下來。用該細(xì)胞所需*培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。
3.采用血球計數(shù)器、細(xì)胞計數(shù)儀按照臺盼藍(lán)拒染法或者使用 Countess®自動細(xì)胞計數(shù)儀測定總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞百分比。根據(jù)所需活細(xì)胞密度，計算凍存培養(yǎng)基需要量。
4.以大約100-200×g的離心力將細(xì)胞懸液離心5至10分鐘。在無菌條件下小心倒掉上清液，不要攪動細(xì)胞沉淀。
注：離心速度和時間取決于細(xì)胞種類。
5.用預(yù)冷的凍存培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀，將其調(diào)整至該細(xì)胞適合的活細(xì)胞密度。
6.將細(xì)胞懸液分裝到若干凍存管中。分裝時，應(yīng)不時輕輕混合細(xì)胞，使其保持均勻的細(xì)胞懸液狀態(tài)。
7.產(chǎn)品僅用于科研使用可控制降溫速度的冷凍裝置冷凍細(xì)胞，使溫度每分鐘大約降低  1°C?；蛘?，將裝有細(xì)胞的凍存管放入凍存盒中，然后將凍存盒置于-80°C條件下過夜。 

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注意事項：
1. 感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在 -70℃，不可多次凍融和放置時間過長，以避免降低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。
2. 進行轉(zhuǎn)化操作時，應(yīng)根據(jù)相應(yīng)溫度及無菌條件的要求進行。
3. 產(chǎn)品僅用于科研為防止轉(zhuǎn)化實驗不成功，可以保留部分連接反應(yīng)液，以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到。
實驗報告：
一、分離與培養(yǎng)：
1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，后將組織剪成1mm3左右大??；
2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；
3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；
4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)
二、免疫熒光鑒定：
1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；
2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；
4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗（Abbioscience公司），然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；
5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗37℃條件下放置1h；
6、用PBS沖洗3次，每次10min，后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。
操作方法（以下操作均按無菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進行）
1 取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，如需分裝可將剛?cè)诨?xì)胞懸液分裝到無菌預(yù)冷的離心管中，置于冰浴中。
●  一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為50-100 μl，可以根據(jù)實際情況分裝使用。應(yīng)注意所用DNA 體積不要超過感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的十分之一。
以下實驗以100 μl感受態(tài)細(xì)胞為例。
2 向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入目的DNA（100 μl 的感受態(tài)細(xì)胞能夠被1 ng 超螺旋質(zhì)粒DNA 所飽和），輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，在冰浴中靜置30 分鐘。
3 將離心管置于42℃水浴中放置60-90 秒，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3 分鐘，該過程不要搖動離心管。
4 向每個離心管中加入900 μl 無菌的SOC 或LB 培養(yǎng)基（不含抗生素）， 混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)1 小時（160-220 轉(zhuǎn)/分鐘），目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達，使菌體復(fù)蘇。
5 將離心管內(nèi)容物混勻，吸取100 μl 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含相應(yīng)抗生素的SOB 或LB 固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37℃培養(yǎng)12-16 小時。
●  涂布用量可根據(jù)具體實驗來調(diào)整。如轉(zhuǎn)化的DNA 總量較多，可取更少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；反之，如轉(zhuǎn)化的DNA 總量較少，可取200-300 μl 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。如果預(yù)計的克隆較少，可通過離心（4,000 rpm, 2分鐘）后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)板）
Porcine Bcl-2 Assaciated X protein, BAX Elisa Kit腎臟髓質(zhì)肽（22-52），人Porcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：96T

Porcine Hydrocortisone, HYD Elisa Kit咽側(cè)體抑制素ⅣPorcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：48T

Porcine Hydrocortisone, HYD Elisa Kit糊精肽，人Porcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：96T

Porcine nitric oxide, NO Elisa Kit血管緊張素APorcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：48T

Porcine nitric oxide, NO Elisa Kit血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑Porcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：96T

Porcine Endothelial nitric oxide synthase, eNOS Elisa Kit血管緊張素原（1-14），大鼠Porcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：48T

Porcine Endothelial nitric oxide synthase, eNOS Elisa Kit肯特肽抗體Porcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：96T

Porcine Endothelial nitric oxide synthase 3, eNOS-3 Elisa Kit心房利鈉肽（1-28）,大鼠Porcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：48T

Porcine Endothelial nitric oxide synthase 3, eNOS-3 Elisa Kit心房利鈉肽（126-149）Porcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：96T

Porcine Angiopoietin 2, ANG-2 Elisa Kit心房利鈉肽（126-150），大鼠Porcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：48T

Porcine Angiopoietin 2, ANG-2 Elisa Kit心鈉素Ⅰ，大鼠Porcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：96T

Porcine tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 2, Tie-2 Elisa Kit心鈉素Ⅱ，大鼠，小鼠，兔Porcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：48T

Porcine tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 2, Tie-2 Elisa Kit心鈉素Ⅲ，大鼠Porcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：96T

Porcine Angiopoietin 1, ANG-1 Elisa Kit帶3蛋白質(zhì)（547-553），人Porcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：48T

Porcine Angiopoietin 1, ANG-1 Elisa Kit帶3蛋白質(zhì)（824-829），人Porcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：96T

Porcine acetylcholine receptor antibody, AChRab Elisa Kit堿性成纖維生長因子Porcine/豬Elisa試劑盒規(guī)格：48T
Rosetta-gami B(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞CCDC67  卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白67一抗    * 0.2ml 1Ethylimidazole

CCDC144A  卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白144A一抗    * 0.2ml 1Naphthalene ethanol

CCDC129  卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白129一抗    * 0.2ml 1Naphthyl acetate

CCDC107  卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白107一抗    * 0.2ml 1Octacosanol

CCDC116  卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白116一抗    * 0.2ml 1Phenyl1Htetrazole5thiol

CCDC117  卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白117一抗    * 0.2ml 2,2Dimethyl1,3propanediol

CCDC127  卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白127一抗    * 0.2ml 2,2Dimethylsuccinic acid

CCDC138  卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白138一抗    * 0.2ml 2,7Dihydroxynaphthalene