反相色譜柱的清洗和再生方法

 反相色譜是迄今在高效液相色譜中應用*泛的技術，主要是因為它適用于分析極大多數(shù)的非極性物質和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜的固定相本質上都是疏水物質，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小程度來分離的，樣品基體中其它疏水雜質組分也能以同樣的方式保留。

除C18、C8、C4、C2、C1、CN、NH2和Phenyl等常見的一些鍵合硅膠固定相外，還有幾個分支品種，如混合相固定相（例如苯基－己基）、封尾和未封尾的填料種類以及極性嵌入固定相等。還有其它很多填料也用于反相色譜，包括聚合物、聚合物包覆硅膠和聚合物包覆氧化鋁、無機－有機雜化物、涂覆氧化鋯和石墨化碳等。不同的固定相分別都有自己的優(yōu)點和缺點。

反相色譜柱通過調節(jié)流動相組成的變化和添加一些試劑的方式，成功實現(xiàn)了許許多多不同的色譜應用。一些技術是利用添加劑改變了填料的表面特性，有時候這些添加劑本身有可能會污染硅膠和鍵合相表面。

硅膠表面除了有疏水鍵合相外，還有別的一些化學特性。殘留的硅醇基存在于所有的硅膠鍵合填料中。這些硅醇基具有弱酸性，因此能與某些待分析物和樣品基體中的雜質相互作用，特別 是堿性物質發(fā)生作用。因為硅醇基的pKa值大約是4.5，離子化能在中性pH條件下發(fā)生，而存在與陽離子產(chǎn)生靜電相互作用的可能。較老的A型硅膠含有高濃度金屬雜質離子（有時候達100ppm或更多），而這能使硅膠表面的酸性更大，甚至能與某些金屬鰲合化合物發(fā)生作用。殘留硅醇基在非末封尾的鍵合硅膠表面和在C2或C4等短鏈硅膠鍵合相填料中，麻煩更大。

必須清楚地了解所用固定相的表面特性和可能存在的分析物－固定相表面的相互作用模式，這樣當用反相色譜方法時才能充分考慮到潛在的樣品基質污染的影響。例如， 疏水性非常強的樣品基質如玉米油、高芳香物質和蠟能粘在反相填料的表面并且改變表面性質。含有類蛋白質物質的生物質樣品也能吸附在填料表面。盡管分析者想盡最大努 力來保護HPLC柱子免受外源物質的污染，但某些分析物－樣品基體的結合作用最終會使固定相受到污染。

當柱子被污染，它的色譜行為和沒被污染的柱子會有些不同。被污染的反相色譜柱會產(chǎn)生反壓問題，必須進行清洗和再生才能恢復到原來或接近原來的狀態(tài)，本文將提出了一些切實可行的恢復方案供大家討論或參考。著重點在鍵合硅膠柱上，其它類型的反相柱的清潔和再生步驟最后也有介紹。

什么原因導致污染物在反相柱上的聚集？

通常，樣品基體中會含有一些對分析者來說不感興趣的東西，如鹽、脂類、含脂物質、腐殖酸、疏水蛋白質和其它一些生物質，是一些可能與HPLC柱發(fā)生相互作用的物質。這些物質和目標分析物比，保留能力有些強，有些弱。那些保留能力小的雜質，如鹽類，通常在死體積處就會被洗脫出來，在譜圖上表現(xiàn)為干擾峰、小斑點、基線擾動、甚至是倒峰等等。而樣品基體中的強保留物質，如果流動相的洗脫能力從來沒有調高到足以把它們洗脫出來，多次上樣后，它們就會在柱頭累積。這種現(xiàn)象通常在等度洗脫時容易觀察到。保留能力中等的雜質能被緩慢洗出而且表現(xiàn)為 寬峰、基線擾動或者基線漂移。
有時，這些被吸附的雜質累積到雜質本身足以作為一種新固定相的程度。分析物能與這些雜質作用，起一定的分離作用。此時保留時間會發(fā)生漂移，并出現(xiàn)峰形拖尾。如果污染程度再嚴重下去，柱子的反壓能超過泵所能承受的最大壓力，依照發(fā)生堵塞的位置不同，可使柱子無法工作或使柱頭塌陷產(chǎn)生空洞。

硅膠基質鍵合反相柱的清洗

再生被污染HPLC柱子的關鍵是知道污染物的性質并且能找到適當?shù)娜軇﹣砣コＨ绻廴臼且驗橹貜瓦M樣時強保留物質的累積引起的，利用簡單的清洗步驟來除去這些污染物往往就能恢復其色譜性能。

經(jīng)過等度運行后的色譜柱，有時用90～100％含量的溶劑B（雙溶劑反相系統(tǒng)中洗脫能力較強的溶劑，如甲醇、乙晴、四氫 呋喃等）沖洗20個柱體積可以清除污染物（色譜柱的柱體積和空柱管體積概念不同，一根4.6x250mm柱子的柱體積只有2.5ml，2.1x150mm的是0.28ml）。

如果使用的是緩沖鹽系統(tǒng)，不要直接切換到強溶劑，突然轉換到高濃度有機溶劑可能會使HPLC流動體系中的緩沖鹽沉淀，這樣會導致更大的問題，如柱頭篩板堵塞、連接管路堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進樣閥轉軸失靈。應該先用無緩沖鹽流動相（即把緩沖液換成水），沖洗5～10個柱體積以后才切換到用強溶劑清洗。
有時候，強溶劑B也沒法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么就需要用更強的溶劑或者是系列溶劑組合。如果污染物不是生物質的，一種強溶劑或幾種溶劑組合清洗基本能解決問題。柱子生產(chǎn)廠家的網(wǎng)頁和產(chǎn)品說明書上很多也有清洗方法推薦。
所有的清洗方法的模式普遍都類似，溶劑系列中所用溶劑的強度逐級增加，最后一個溶劑往往是非極性（疏水性）很強的（如醋酸乙酯甚至是烷烴），以便于溶解脂質、油類等非極性污染物。溶劑系列中每個溶劑都保證能與下一個溶劑互溶。整個清洗過程結束后，在回到原來的流動相體系前，必須借助一個中等強度的互溶性非常好的溶劑過渡。例如， 異丙醇是一個非常好的過渡溶劑，它既能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過高。

還有，如果使用紫外檢測器，須避免選用在紫外區(qū)域有吸收的溶劑，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。
對于典型的硅膠基質鍵合反相柱，在未使用緩沖溶液的條件下，推薦使用以下清洗溶劑系列：
      100％甲醇---100％乙晴---75％乙晴/25％異丙醇---100％異丙醇---100％二氯甲烷---100％正己烷
用每種溶劑沖洗至少10個柱體積，對于250mm×4.6mm的分析柱，合適的沖洗流速是1～2ml/min。最后用10柱體積的異丙醇過渡，然后回到原來的流動相體系（但不含緩沖鹽），最后回復到起始流動相配置。

四氫呋喃也是另外一種常用的清洗溶劑。如果懷疑柱子被嚴重污染，還可用二甲亞砜（DMSO）或 二甲基甲酰銨和水按50：50的比例混合，以低于0.5ml/min的流速沖洗色譜柱。

成功再生反相柱子是一個非常耗時的過程，溶劑沖洗序列可以編成一個梯度洗脫的程序自動進行，以方便過夜操作。

清洗硅膠基質鍵合反相柱上的蛋白質殘留

如果是生物物質如血漿或血清等積累在反相色譜柱上，必須采用稍不同的清洗方法。大部分情況下，純有機溶劑如乙腈或甲醇不能溶解多肽和蛋白質,就不能有效地清洗柱子。不過由有機溶劑和緩沖液、酸,有時還加上離子對試劑等組成的混合液能有用。開始可嘗試用高比例的的強溶劑（溶劑B）沖洗。

Freiser和他的合作者發(fā)現(xiàn):重復進行梯度洗脫,可以再生被污染的反相柱子。Bhadwaj和Day認為在250mm×46mm的柱子中注入100μL的三氟乙醇就能起到效果。如果上述幾個方法都不成功，Cunico和他的同事推薦了幾種強溶劑或增溶劑可用來除去蛋白質（見下所列）。

清洗溶劑                      組成

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醋酸                              1%水溶液

三氟醋酸                          1%水溶液

0.1%三氟醋酸水溶液/丙醇        40:60(v/v)(較粘,需降低流速)

TEA(三乙胺)/丙醇               40:60(v/v)(混合前用0.25N磷酸和三乙胺調pH到2.5)

脲或胍的水溶液                 5-8M(調pH到6-8)

氯化鈉、磷酸鈉或硫酸鈉溶液     0.5-1.0M（磷酸鈉pH7.0）

DMSO/水 或二甲基甲酰胺/水      50：50（v/v）                   

在使用這些清洗溶劑之前，可以先咨詢柱子的廠商確保這些溶劑不會對填料帶來損壞。硅膠基質的柱子通常來說都是可以的，但某些洗滌溶劑的配方可能會使有機聚合物基質的填料膨脹或收縮，從而影響其色譜性能。

須確保上表用的清洗溶劑能與先前用過的溶劑互溶，丙醇可以作為很好的過渡。對每個溶劑系統(tǒng)至少要沖洗20個柱體積。由于有些溶劑系統(tǒng)黏度很大，沖洗的流速應該相應調整以確保不會超過泵壓。用完胍或脲等溶劑清洗柱子后，至少應該用40～50柱體積的HPLC級純水來沖洗。

對于反相柱子，不建議用表面活性劑如十二烷基磺酸鈉（SDS）和Trition，因為這些化合物必然會牢固吸附在硅膠鍵合相柱子上，很難除去。用表面活性劑會影響改變填料表面性質。然而，Separation Group的研究表明:多肽合成產(chǎn)生的保護基和清除劑對柱子的污染，可以通過在流動相中加入500μL 1％SDS溶液以1ml/min的流速清洗掉。然后再用從5％～95％乙腈/1％（v/v）三氟醋酸的梯度洗脫，在起始條件平衡后，就可以恢復柱子的多肽分離功能。

清洗反相柱的特殊技巧 

有時用有機溶劑清洗污染柱子并不能成功，尤其是有金屬離子吸附在硅膠或鍵合相上時，這種情況下，可用鰲合劑如0.05M乙二胺四乙酸（EDTA）沖洗色譜柱，EDTA能與許多金屬離子絡合并溶解它們。用完EDTA溶液后，一定要用水充分沖洗柱子。如果樣品中含離子化合物，改變pH可以使它們轉為非離子狀態(tài)，這樣就可以被水/有機溶劑洗脫下來。例如，強堿性雜質能在pH低于3時被除去，在這個條件下質子銨變得水溶性更好。酸性雜質能在pH調整到大于其pKa時被洗下來--大約時pH8或9，此時酸性雜質處于離子狀態(tài)。然而，要注意硅膠柱子在長時間處于高pH條件下容易被破壞。

要避免緩沖液或用緩沖液保存的柱子長菌，可以用普通家用漂白劑1：10或1：20稀釋后來沖洗，50柱體積沖洗后，接著至少要用50柱體積色譜純的水沖洗。不能讓漂白水通過檢測器，因為漂白水會腐蝕檢測池。避免溶劑瓶中緩沖液長菌，每次只取足夠的緩沖液用，把沒用的保存在冰箱里，不能讓不流動的緩沖液在柱子中長期存在。

色譜工作者經(jīng)常會討論到離子對色譜中離子對試劑對固定相的影響。顯然離子對試劑如辛烷－磺酸（用于陽離子）和四烷基銨溴（用于陰離子）在一定濃度的有機修飾劑下能很強地吸附在硅膠鍵合柱子上，柱子因此被污染且很難回復到起始狀態(tài)。因此，一般認為用過離子對試劑的柱子都應該專用，而不能再當常規(guī)的反相色譜柱用。

Bidlingmeyer不同意這種觀點，他認為：離子對色譜所用的pH酸度或堿度很大，在酸性條件下（pH1-3）使鍵合相和封尾試劑水解，在高pH條件下（pH7-8）溶解硅膠基質，因而使一些柱子的性能改變。要清除磺酸離子對試劑，他建議首先用原先的流動相（僅少了離子對試劑）至少沖洗20柱體積，然后用無緩沖液的流動相沖洗(在這個清洗步驟中，甲醇可能比乙晴更有效；如果是長鏈的離子對試劑，則用四氫呋喃)。很明顯，磺酸離子對試劑和銨離子對試劑有著不同的表現(xiàn)。Bidlingmeyer和他的合作者證明了：在C18柱子上用甲醇比例超過70%的流動相，長鏈離子對試劑，如SDS不會吸附在固定相上。這個發(fā)現(xiàn)跟Separation Group的結果一致。

硅膠鍵合整體柱如Chromolith 柱子（德國默克公司產(chǎn)品），清洗時可跟別的硅膠柱一樣處理。