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技術(shù)文章

培養(yǎng)基不能正常凝固的原因及解決辦法

閱讀:102          發(fā)布時(shí)間:2024-11-22

  瓊脂具有特殊的溶點(diǎn)和凝固點(diǎn),所含成分很難被微生物分解利用且不含抑制性成分,因此很適用于微生物培養(yǎng)基的制備,從而作為固體培養(yǎng)基最chang用的凝固劑,到目前為止,在這方面世界上還沒有一種能夠替代瓊脂的代用品。

  一些初期從事植物組織培養(yǎng)工作或微生物培養(yǎng)的人員,尤其是初學(xué)者,在配制培養(yǎng)基時(shí)往往會(huì)遇到培養(yǎng)基難以正常凝固的現(xiàn)象:或呈半流體、或wanquan呈液體狀態(tài)、同時(shí)還會(huì)現(xiàn)出各種顏色。本文將對(duì)瓊脂的凝固性以及影響其凝固性的關(guān)鍵因素作系統(tǒng)的介紹,并針對(duì)不同的操作方法進(jìn)行問答式評(píng)價(jià),以期能幫助更多的人解決實(shí)際工作中的相關(guān)問題,少走彎路。

一、有關(guān)瓊脂的知識(shí)

  瓊脂,又名瓊膠或凍粉,因最初從日本海藻中提取,故又稱“洋菜"。瓊脂成品為白色或淡黃色粉末狀或細(xì)條形,主要是由復(fù)雜的大分子多糖類物質(zhì)組成。其水解物的組成有40%的D-半乳糖、3%硫酸酯和2%丙酮酸,實(shí)際上,它是瓊脂膠和瓊脂糖兩種成分的混合物。瓊脂膠是瓊脂糖的硫酸酯,瓊脂糖主要依靠氫鍵的引力形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。因此,瓊脂糖凝膠的穩(wěn)定性比那些以化學(xué)鍵交聯(lián)而形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝固劑的穩(wěn)定性要差一些。

  瓊脂溶于熱水而不溶于冷水,因此在配制培養(yǎng)基時(shí)需煮制瓊脂。隨著溫度的升高,瓊脂逐漸溶解,當(dāng)溫度下降到40℃時(shí)則開始凝固。配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意,由于各地生產(chǎn)的瓊脂的質(zhì)量不同,同樣濃度的瓊脂水溶液凝固后在硬度、透明度及色澤上會(huì)有所差異。劣質(zhì)瓊脂不僅凝固性差,而且?guī)в泻芏嚯s質(zhì)。


二、有關(guān)瓊脂凝固性的知識(shí)

  作為培養(yǎng)基的凝固劑,瓊脂的凝固性除與瓊脂本身的品質(zhì)有關(guān)外,還會(huì)受到滅菌溫度、滅菌時(shí)間、瓊脂量和pH值的影響。

  (1)0.7%~0.8%的瓊脂水溶液在冷卻后會(huì)很好凝固,對(duì)于常用的微生物培養(yǎng)基,瓊脂的用量基本趨于穩(wěn)定,通常條狀瓊脂的用量約為2%,粉狀瓊脂的用量為1%~1.5%。

  (2)培養(yǎng)基的酸堿度對(duì)瓊脂的凝固性影響很大,是瓊脂在正常濃度范圍內(nèi)能否凝固的關(guān)鍵因素,當(dāng)4.30<ph<10.05時(shí),瓊脂水溶液均可正常凝固,超過此范圍,瓊脂的凝固性變差,培養(yǎng)基不能正常凝固。< span="">

  (3)在4.30<ph<10.05范圍內(nèi),瓊脂的凝固性受高溫高壓(1.1 kg="" cm<="" span="">2,120℃)的影響很小,延長(zhǎng)高溫高壓滅菌時(shí)間或反復(fù)高溫高壓處理均不會(huì)影響其凝固性。pH較高(5.0-8.0)時(shí),瓊脂濃度是影響凝固等級(jí)的主要因素。

<ph<10.05范圍內(nèi),瓊脂的凝固性受高溫高壓(1.1kg cm

  (4)當(dāng)配制的固體培養(yǎng)基pH低于3.44時(shí),其凝固性會(huì)受到滅菌溫度、滅菌時(shí)間、瓊脂量和pH值的影響。其中滅菌溫度、滅菌時(shí)間與瓊脂凝固性呈負(fù)相關(guān),瓊脂量、pH值與瓊脂凝固性呈正相關(guān)。但在這些因素中,瓊脂量的影響不是很大,因此在該類培養(yǎng)基的滅菌過程中應(yīng)該重點(diǎn)把握好滅菌溫度、滅菌時(shí)間和pH值。使用較低的滅菌溫度,較短的滅菌時(shí)間,適當(dāng)?shù)卦黾优囵B(yǎng)基的pH值就可以顯著提高瓊脂的凝固性。pH較低(≤4.0)時(shí),pH是影響凝固等級(jí)的主要因素。


三、案例分析

  基于實(shí)驗(yàn)得出的理論知識(shí),大家都比較好理解和接受,但在實(shí)際操作過程中,經(jīng)常會(huì)有人碰到瓊脂不能凝固的情況(如圖1),下面針對(duì)具體案例進(jìn)行分析討論:

圖1 滅菌后的培養(yǎng)基出現(xiàn)分層現(xiàn)象

案例一

  問:我使用的是**生產(chǎn)的瓊脂,用冷水就能溶解了,高壓蒸汽滅菌后就能使用了,最近在倒平板時(shí),發(fā)現(xiàn)有幾塊怎么也不凝固,同一瓶子里的瓊脂只有幾塊不凝固,我專門放到第2天發(fā)現(xiàn)還是稀呼呼的。

  答:首先糾正一下,您說用冷水就能溶解了,這肯定不對(duì):瓊脂溶于熱水而不溶于冷水,將瓊脂放在冷水中,充其量只能是把瓊脂浸濕了泡軟了,根本達(dá)不到溶解的程度,也就談不上均勻地分散在培養(yǎng)基溶液中了。既然分散不均勻,滅菌后倒出的平板,就容易產(chǎn)生瓊脂含量不一的結(jié)果,表現(xiàn)出來的現(xiàn)象就是您所描述的,同一瓶子里的瓊脂,有幾塊怎么也不凝固,即使放到第2天或更多天,也不會(huì)凝固,因?yàn)槔锩娴沫傊亢苌侔?,達(dá)不到凝固的要求,即使放再多時(shí)間結(jié)果也是一樣。

  問:必須要wanquan煮化嗎?

  答:瓊脂必須煮沸,常溫下是溶解不了的,只有煮沸后再冷卻才會(huì)凝固。

  問:夏天溫度高的時(shí)候是不是就不用煮沸了?

  答:配好培養(yǎng)基后,一定要加熱攪拌溶解。培養(yǎng)基外包裝標(biāo)簽上說得很清楚,要加熱煮沸至wanquan溶解,夏天溫度再高也不會(huì)超過50度吧?所以天氣熱了也要這么做,使得培養(yǎng)基中各成分混合均勻。步驟不要省略?。?!

  問:那我們以前都是同樣的操作,怎么都好著呢?

  答:正確的培養(yǎng)基配制方法應(yīng)該是先將含瓊脂培養(yǎng)基煮沸至wanquan溶解之后,再分裝入三角瓶中進(jìn)行滅菌,并且滅菌完畢從鍋里拿出來后,要及時(shí)搖一搖三角瓶(用力搖),使滅菌后的培養(yǎng)基中瓊脂能夠均勻分散在里面,然后再傾倒平皿。你之前沒出問題,不代表你的操作就是合乎要求的,你不按照正規(guī)的方法操作,遲早會(huì)出問題的,這不就被你碰到了嗎?

  另外,即使滅菌前沒有先煮沸再分裝滅菌,只在滅菌完畢,開鍋后第一時(shí)間將瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基搖勻,也就不會(huì)出現(xiàn)你碰到的問題了。

  這里需要注意,搖勻,一定是用力搖勻,而不是隨手輕輕一晃就行了。

  問:為何還要搖???你在煮沸、滅菌時(shí),不就自然勻了嗎?

  答:滅菌時(shí)能自然勻了?這也是你自己認(rèn)為的吧?當(dāng)然很多人都會(huì)這么認(rèn)為。熬粥的時(shí)候滿鍋里都沸騰,稍放置一會(huì)兒,鍋底的粥是不是要稠一些?大同小異!

  問:可是滅菌后搖晃容易產(chǎn)生氣泡?。?/strong>

  答:開鍋拿出來后手搖幾下就勻了,少量氣泡稍微靜置就會(huì)消掉的,或者放到水浴鍋里恒溫到50度的時(shí)候一般就沒有氣泡了。臨倒平板前就不要搖了!那時(shí)候再搖,氣泡可能就不容易消掉了。

  問:那我怎么搖勻?我用500mL的三角瓶配500mL培養(yǎng)基,根本搖不起來!

  答:?jiǎn)栴}就出來這里,做微生物實(shí)驗(yàn),將配好的培養(yǎng)基分裝到適當(dāng)容器中,培養(yǎng)基體積不應(yīng)超過容器容積的2/3(可參考GB 4789.28食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求)。也就是說不要將瓶子里裝得滿滿當(dāng)當(dāng)?shù)?,這樣很容易導(dǎo)致瓊脂沉在下面,不容易搖勻。

  我們平時(shí)做實(shí)驗(yàn),配500mL培養(yǎng)基用1000mL的瓶子,配200mL培養(yǎng)基用500mL瓶子,500mL的瓶子里最多裝400mL培養(yǎng)基的,你比較看看你的裝量。

  問:我們一直都這么配制的,只是最近的出了問題,同一瓶培養(yǎng)基,只有幾個(gè)板這樣的。

  答:培養(yǎng)基的標(biāo)簽上有明確的用法:稱23.5 g于1 L蒸餾水中,加熱煮沸wanquan溶解,121攝氏度滅菌15分鐘,冷卻至46攝氏度左右備用。

  對(duì)比上面的解答,看看你們一直以來的操作有哪些問題吧,然后按照正規(guī)的操作要求再堅(jiān)持一段時(shí)間,再出現(xiàn)同樣的問題再來找我好吧?(不搖勻的情況下,同一瓶培養(yǎng)基倒出的平板強(qiáng)度差異很大,可參考附錄表格)。


案例二

  問:配制的是營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,都是按照上面說的配制的,滅菌后放入冰箱怎么也不能wanquan凝固,在底部還有非常硬的像膠皮一樣的胨。請(qǐng)幫忙看看到底是怎么回事。

  答:有沒有想過最底部的非常硬的膠皮一樣的東西是什么?那就是相對(duì)很濃的瓊脂液冷卻形成的。如果把這一部分瓊脂趁熱搖勻,使其均勻分散在整瓶培養(yǎng)基里面呢?是不是上面就沒那么稀了,能凝固了,下面也沒那么稠了,硬度合適了。也就是說搖勻后倒平皿,整瓶培養(yǎng)基都能用了。

  你滅菌后沒經(jīng)過搖勻,瓊脂本來就沉積在瓶底,直接放入冰箱,瓶底迅速冷卻,大量的瓊脂就先凝固了,瓶子上面的部分含瓊脂就很少了,所以才會(huì)不凝固。不管放多久都不會(huì)改善??!

  問:聽說瓊脂太酸也不會(huì)凝固,是不是我們使用的培養(yǎng)基pH不合格啊?

  答:pH合格不合格,你測(cè)一下不就知道了。在pH 5-10之間,pH對(duì)瓊脂的凝固性影響并沒有那么大。你用的都是常規(guī)培養(yǎng)基,pH怎么可能那么低嘛。另外,如果是pH值太低的話,加熱以后瓊脂會(huì)變性,底部就不會(huì)有凝固的瓊脂硬塊了,而會(huì)成一瓶糊糊。你這顯然是瓊脂混合不均勻引起的,使用前用微波溶化,晃一晃就好了。

  問:用兩個(gè)大燒杯把融化了的培養(yǎng)基來回傾倒混勻,然后倒皿,效果不錯(cuò)。

  答:道理是一樣的,就是為了使瓊脂混合均勻。但這種操作方法有點(diǎn)繁瑣,并且容易染菌,不提倡。

  問:像我這種情況,培養(yǎng)基還能用嗎?

  答:能用!重新水浴加熱,讓其wanquan溶解后,搖勻,傾倒平板即可?;蛘哂梦⒉訜?,要注意隨時(shí)觀察,經(jīng)常拿出來搖一搖,以免培養(yǎng)基噴出。

  問:培養(yǎng)基可以多次這樣反復(fù)融化使用嗎?

  答:不建議!如果不是不得已,建議現(xiàn)滅現(xiàn)用。


案例三

  問:今天分別用了伊紅美藍(lán)瓊脂和營養(yǎng)瓊脂兩種培養(yǎng)基做斜面,然而滅菌后做斜面都不凝固,這是為啥?有的凝固也就是一半凝。

  我的步驟:如營養(yǎng)瓊脂,按配比稱3.3g加100mL水,加熱攪拌溶解,分裝到試管中后加棉花塞,包扎后于121℃滅菌鍋中滅菌20分鐘,好了之后制作斜面,等了有半小時(shí)久,培養(yǎng)基都不凝固這是為何?

  答:你先要煮沸溶解培養(yǎng)基,攪拌均勻,稍冷后(50℃)盡快分裝,瓊脂的在水中需加熱至95℃時(shí)才開始熔化,你只是加熱攪拌溶解,瓊脂是不是真正溶解透了有待考證。

  試管滅菌完畢,拿出來晃一晃再擺斜面,否則容易上層稀不凝固,下層濃很容易凝固。跟三角瓶滅培養(yǎng)基是一樣的道理。

  問:我煮了還是沒很凝固這是為什么?

  答:先加熱煮沸,直至白色泡沫上升,然后再分裝、高溫高壓滅菌。

  問:白色泡沫上升好危險(xiǎn),我試過被瓊脂沸騰連塞子噴我一臉!

  答:我們通常都是用搪瓷缸,最多裝液量1/3,煮沸三次,徹di煮透、溶透。

  問:溶解后用吸量管分裝,在吸量管中就凝固了,要怎么分裝?量筒嗎?

  答:我們都是用10 mL或5 mL移液槍分裝的,再把分裝試管塞好滅菌。

  煮沸溶解分裝然后滅菌制斜面成功了!再次提醒,滅菌后,溫度沒降下來前一定要搖一搖,不管瓶裝還是試管裝,都要搖勻??!


案例四

  問:瓊脂培養(yǎng)基制作斜面為什么無法wanquan凝固,而做培養(yǎng)皿時(shí)wanquan凝固?

  答:瓊脂混合不均勻。相比三角瓶,試管的空間更加狹小,開鍋后一定要趁熱晃一晃,使底部沉積的瓊脂wanquan混勻。否則就容易導(dǎo)致試管底部凝固,而上部不凝固或凝固不好的問題。


案例五

  問:微生物檢驗(yàn)用的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,可以第二次高壓滅菌么?有何影響,如果加熱培養(yǎng)基使其溶化后,不一會(huì)兒就會(huì)凝,而如果用高壓滅菌就不會(huì)很快凝固,所以想再用高壓濕熱滅菌,加熱使其溶化,可否?

  答:二次高壓濕熱滅菌,會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)成分的損失。所以,最好是通過水浴加熱,溫度維持在100度,瓊脂就可wanquan化開,冷卻至50度左右,就可進(jìn)行倒板等操作了。

  問:培養(yǎng)基能加熱幾次?營養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉配置好了以后,我是保藏在冰箱里的,同一瓶最多能水浴幾次使用呢?

  答:在保證不染菌的情況下是可以多次使用的。瓊脂的溶解溫度是95度,若水浴的話時(shí)間來得及可以是沸水浴。若是時(shí)間緊迫可直接放在電爐上熔化,但要一直盯著,防止沸出來。如果是已經(jīng)滅好菌的玻璃器皿,可以用微波爐加熱,不過要注意觀察,防止沸騰出來。一般從冰箱里拿出來就用一次,不提倡反復(fù)融化。

  問:有人說加熱時(shí)間過長(zhǎng),也會(huì)導(dǎo)致瓊脂不凝固,是這樣嗎?

  答:是的。通常來說,滅完菌就要及時(shí)開鍋取出培養(yǎng)基。如果因?yàn)槠渌?,耽誤了,稍有延長(zhǎng)也不大要緊,這里所說的加熱時(shí)間過長(zhǎng),是指高壓超過半小時(shí)或者滅菌后一直放在滅菌鍋內(nèi)很長(zhǎng)時(shí)間甚至過夜的情況。這些都是錯(cuò)誤的操作,即使培養(yǎng)基能凝固,里面的營養(yǎng)成分也發(fā)生了很大的變化,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷造成很大影響。應(yīng)該杜絕類似的操作。


  通過上述幾個(gè)案例的分析,我們可以總結(jié)一下。遇到固體培養(yǎng)基不凝固的情況,通常首先考慮一下幾點(diǎn):

  (1)瓊脂少,特別是自己配制培養(yǎng)基時(shí),可能根本就漏加瓊脂了;

  (2)pH值不對(duì),實(shí)驗(yàn)室用水PH過低,且配制完沒能調(diào)整pH,或者本身就是酸度很大的培養(yǎng)基;

  (3)反復(fù)加熱;

  (4)加熱時(shí)間過長(zhǎng);

  (5)滅菌前是否煮沸溶透,滅菌后是否搖勻。

  結(jié)合自己的實(shí)際操作,一項(xiàng)一項(xiàng)排除查找原因。這里面,zui簡(jiǎn)單也最容易被忽視的就是滅菌后搖勻的問題。

  本實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn),傾倒平皿前搖勻與不搖勻,所形成的平板強(qiáng)度差異很大,如果不經(jīng)搖勻直接傾倒,形成的平板有約有2/3凝膠強(qiáng)度過低,不能滿足試驗(yàn)要求,而最后倒出的幾塊平板強(qiáng)度會(huì)急劇升高,硬度過大,也影響使用;而搖勻后再傾注的平板,凝膠強(qiáng)度數(shù)值分布比較均勻,滿足試驗(yàn)要求(表1,圖2)。經(jīng)常聽到有人說,平常一直那么做(不煮沸,不搖勻),都沒問題,實(shí)際上那樣倒出來的平板只是都凝固了而已,即使能用,平板間凝膠強(qiáng)度的差異也是很大的。

  希望大家在實(shí)際操作中一定注意,嚴(yán)格按照說明書的要求進(jìn)行操作。


附圖表:

表1 用相同方法配制的等量培養(yǎng)基開鍋后搖勻與不搖勻傾倒成的平板強(qiáng)度

傾注平板先后編號(hào)

凝膠強(qiáng)度(g/cm2

不搖勻

搖勻

1

8

439

2

10

403

3

14

463

4

16

402

5

20

415

6

26

464

7

90

426

8

398

442

9

631

390

10

1180

428

11

1963

362

12

2266

452

13

2525

374

14

2495

376


圖2 傾倒平板前培養(yǎng)基搖勻和不搖勻所傾注的平板強(qiáng)度規(guī)律




注:本文屬海博生物原創(chuàng),未經(jīng)允許不得轉(zhuǎn)載。


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