標簽：生物反應器 成纖維細胞  科普 胰蛋白酶 

實驗前準備和實驗方法

1.動物和試劑

野生型 C57BL/6 小鼠。以下抗體用于免疫細胞化學：抗肌節(jié) α-肌動蛋白 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、抗心肌肌鈣蛋白 T 和抗肌球蛋白重鏈 小鼠單克隆抗體和豚鼠單克隆抗波形蛋白抗體。除非另有說明，試劑品牌選用Sigma。

2.小鼠 ES 細胞培養(yǎng)

維持在α-肌球蛋白重鏈啟動子控制下表達EGFP的小鼠ES細胞 。R1 ES 細胞普遍表達 EYFP、在 α-肌球蛋白重鏈啟動子和潮霉素抗性基因上游的磷酸甘油酸激酶控制下的新霉素磷酸轉移酶基因，進行維持。

3.生物反應器系統(tǒng)

     生物反應器培養(yǎng)系統(tǒng)采用使用1L左右的臺式細胞培養(yǎng)生物反應器。該生物反應器配備有溫度傳感器、PH控制系統(tǒng)、和溶氧度感應系統(tǒng),，以及補料、收獲和樣品端口。數(shù)據(jù)采集及過程控制均采用微電腦自動化控制，生物反應器內部的空氣、氧氣或氮氣將溶解氧維持在40%左右為宜。通過 CO 將 pH 值保持在 7.22培養(yǎng)基呈堿性時加入；當介質呈酸性時，不調節(jié) pH 值。溫度保持在37°C。使用帶有 CCD 相機的運動分析顯微鏡記錄容器中 EB 的流動。也可以在 CO2 培養(yǎng)箱中使用配備不調節(jié)條件的傳感器的容器作為對照。

(上圖為：生物反應器系統(tǒng)中培養(yǎng)基中溶解氧濃度對細胞增殖和心臟分化的影響)

4.生物反應器培養(yǎng)

     對于檢查心臟分化功效的實驗，我們使用 100-ml 或1L細胞罐培養(yǎng) EMG7 ES 細胞，在生物反應器中添加 10% FBS、非必需氨基酸 (Invitrogen) 和丙酮酸鈉的格拉斯哥必需培養(yǎng)基 (Invitrogen)。胰蛋白酶消化后，將 1×10 7 個mES 細胞重新懸浮在 100 ml 分化培養(yǎng)基（1×10 5 個細胞/ml）中，并接種到 100-ml 攪拌生物反應器中。第3天，收集培養(yǎng)在容器中的EB，在相同條件下重新接種到4個新容器中，每天*更換培養(yǎng)基（100 ml/天）或連續(xù)更換（100 ml/天）。

（下圖為：生物反應器系統(tǒng)中葉輪攪拌速度對細胞增殖的影響）

      用于收集心肌細胞以創(chuàng)建細胞片，1×10 7使用 100-ml 或 1-L 培養(yǎng)容器培養(yǎng) R1 mES 細胞，DMEM 補充有 15% FBS、非必需氨基酸、丙酮酸鈉和 L-谷氨酰胺 (Invitrogen)。對于 100 ml 培養(yǎng)，第 3 天容器中的 EB 在相同條件下重新接種到 4 個新容器中，每天*更換培養(yǎng)基（100 ml/天）或連續(xù)更換（100 ml/天） ）。對于 1-L 培養(yǎng)，在第 3 天將兩個容器中的 EB 在相同條件下重新接種到 1-L 容器中，但攪拌速率除外（100-ml 培養(yǎng)，85 rpm；1-L 培養(yǎng)，65 rpm） . 連續(xù)更換培養(yǎng)基（1 L/天）。對于含有生長因子的 1-L 培養(yǎng)物，在生物反應器培養(yǎng)開始前 3 天到后 1 天用 Noggin (150 ng/mL) 培養(yǎng)細胞，從生物反應器培養(yǎng)的第 6 天到第 10 天用 GCSF (1 ng/mL) 培養(yǎng)細胞。在用 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 解離 EB 后測量每個時間點的細胞數(shù)。對于心肌細胞的純化，從心臟分化的第 10 天到第 18 天，將 400 µg/ml G418 添加到培養(yǎng)物中。在一些實驗中，將 R1 ES 細胞培養(yǎng)在一個類似的 100-ml 生物反應器容器中，作為對照，在 CO2 培養(yǎng)箱中進行調節(jié)。

（下圖為：心臟基因mRNA表達水平的比較）

5.流式細胞儀分析和熒光激活細胞分選

每個時間點的 EB 與 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 解離 30 分鐘，并使用流式細胞儀分析 GFP(+) 細胞的百分比。對于細胞分選，可使用流式細胞分篩系統(tǒng)進行熒光激活細胞分選。EB5 mES 細胞用作陰性對照。

6.生化分析

每天從生物反應器培養(yǎng)系統(tǒng)收集培養(yǎng)上清液。使用生物傳感器進行葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和谷氨酸的測定。

7. RNA提取和RT-PCR

下一步按照基因學實驗步驟進行總 RNA 提取和 RT-PCR 。定量PCR可使用朗基Q2000B進行PCR實驗，實驗條件為 94°C 初始變性 15 秒，而后 55°C， 30 秒和 72°C， 35 秒的 60 個循環(huán)，然后在 60-95°C 進行熔解曲線分析。使用 GAPDH mRNA 水平的標準曲線計算相對 mRNA 表達水平。對于每個基因，所有樣品至少獨立分析 3 次。

8.免疫細胞化學

細胞用 4% 多聚甲醛固定，進行免疫染色。再通過激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡和凝膠成像系統(tǒng)進行細胞免疫分析。

9.細胞分離

從新生小鼠（1-2 天齡）的心臟中獲得心臟成纖維細胞。來自第4代的心臟成纖維細胞用于實驗。免疫細胞化學分析顯示>99% 的心臟成纖維細胞表達波形蛋白，不表達血管性血友病因子（內皮細胞標記）或 NG2（周細胞標記）。

10.細胞接種

將從成年小鼠分離的ES細胞衍生的心肌細胞和真皮成纖維細胞的混合細胞懸液以3.2×10 5 個細胞/cm 2接種到細胞培養(yǎng)瓶中，細胞在添加了15% FBS的DMEM中于37℃培養(yǎng)。培養(yǎng) 2 天后，使用細胞片堆疊操作技術收獲細胞片并分層。

11.細胞片的組織學和免疫組織化學分析

為了觀察多層細胞片的橫截面，多層細胞片用4%多聚甲醛固定，并常規(guī)加工成3mm厚的石蠟包埋切片。通過常規(guī)方法進行蘇木精和伊紅（HE）染色和azan染色。

12.統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差。通過學生t檢驗或方差分析評估組間差異，然后進行 Bonferroni 校正以比較平均值。p <0.05的值被認為具有靜態(tài)顯著性。

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