標簽：細胞系 原代培養(yǎng)   動物細胞培養(yǎng)  細胞培養(yǎng)

ATCC 細胞系和雜交瘤在干冰上冷凍在冷凍保存小瓶中運輸，或在環(huán)境溫度下作為培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)生長物的運輸。收到冷凍細胞后，重要的是要立即通過解凍和去除 DMSO 并將它們放入培養(yǎng)物中來恢復(fù)它們。如果這是不可能的，請將細胞儲存在液氮蒸氣中（低于 -130°C ）。不要將冷凍細胞儲存在 -130°C 以上的溫度，因為它們的活力會迅速下降。

培養(yǎng)基的制備

通過組裝適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、血清和生長所需的其他試劑，為恢復(fù)細胞系做好準備。這些產(chǎn)品中有許多可從 ATCC 獲得，并且可以與細胞系一起訂購。這些試劑與 ATCC 用于細胞生長和保存的試劑相同。 雖然大多數(shù)細胞系可以在一種以上的培養(yǎng)基中復(fù)制，但當(dāng)培養(yǎng)基改變時，它們的特性可能會改變。因此，建議在 ATCC 使用的相同培養(yǎng)基中開始細胞培養(yǎng)以獲得最佳結(jié)果（參見產(chǎn)品信息表和 ATCC 網(wǎng)站）。

ATCC 細胞系的培養(yǎng)

1.準備一個培養(yǎng)容器，使其包含產(chǎn)品表中列出的推薦體積的適當(dāng)培養(yǎng)基，并針對溫度和 pH 值 (CO 2 ) 進行平衡。

2.在 37°C 或該細胞系的正常生長溫度的水浴中輕輕攪拌，解凍小瓶。解凍應(yīng)該很快，大約 2 分鐘或直到冰晶融化。

3.從水浴中取出小瓶并通過浸入或噴灑 70% 乙醇來凈化它。在層流組織培養(yǎng)罩中遵循嚴格的無菌條件進行所有進一步操作。

4.擰開小瓶的頂部，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含有 9 mL 推薦培養(yǎng)基的無菌離心管中。通過溫和離心（125 × g 下 10 分鐘）除去冷凍保護劑 (DMSO)。

5.丟棄上清液，將細胞重新懸浮在 1 或 2 毫升的*生長培養(yǎng)基中。將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到含有*生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中，輕輕搖動*混合。

6.在24 小時后檢查細胞培養(yǎng)物，并根據(jù)需要進行繼代培養(yǎng)。這里需要注意的是一些細胞系，例如雜交瘤，需要幾天時間才能從冷凍保存中*恢復(fù)。一些雜交瘤在培養(yǎng)的第一天存活率很低，會產(chǎn)生細胞碎片。在此之后，細胞培養(yǎng)將開始恢復(fù)并進入指數(shù)增長。

處理搖瓶內(nèi)的培養(yǎng)物

一些 ATCC 細胞作為培養(yǎng)容器中的生長培養(yǎng)物運輸。這些容器中接種細胞，培養(yǎng)以確保細胞生長，然后*填充培養(yǎng)基以進行運輸。

收到搖瓶培養(yǎng)物后，目視檢查培養(yǎng)基是否有微生物污染的宏觀證據(jù)。這包括不尋常的 pH 值變化（酚紅呈黃色或紫色）、濁度或顆粒。使用低倍（100 倍）倒置顯微鏡檢查培養(yǎng)基中是否有微生物污染的證據(jù)以及細胞的形態(tài)。

如果細胞附著并以單層生長：

需要以無菌方式去除除 5 mL 至 10 mL 外的所有運輸介質(zhì)。運輸介質(zhì)可以保存以備重復(fù)使用，并應(yīng)儲存在 4°C。

在產(chǎn)品說明書中推薦的溫度和 CO 2濃度下（37°C，大多數(shù)細胞系為5% CO 2 ）孵育培養(yǎng)瓶，直到細胞傳代。

如果細胞未附著或懸浮生長：

將搖瓶中的全部內(nèi)容物無菌轉(zhuǎn)移到離心管中。

以 125 × g 離心 5 到 10 分鐘。

除去 10 mL 的運輸介質(zhì)上清液，然后重新懸浮細胞。將此培養(yǎng)基的剩余部分儲存在 4°C 以備后用。

根據(jù)細胞系，將重懸的細胞無菌轉(zhuǎn)移到 25-cm 2燒瓶或 75-cm 2燒瓶中（參見產(chǎn)品表）。

在產(chǎn)品信息表中推薦的溫度和 CO 2濃度下孵育細胞，直到細胞進行傳代培養(yǎng)。

原代細胞的特點

由于大多數(shù)細胞系都是從一塊切碎或酶分散的組織開始的原代培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)物是幾種細胞類型的混合物，保留了其源組織的特征。

一段時間后，原代培養(yǎng)物將達到匯合，即由于細胞膨脹而覆蓋培養(yǎng)容器的所有可用空間的狀態(tài)。此時，需要將培養(yǎng)物分解（通常使用胰蛋白酶等蛋白水解酶）分解為單個細胞并進行繼代培養(yǎng)（分裂、傳代或轉(zhuǎn)移）。在第一次傳代之后，培養(yǎng)物通常被稱為細胞系。隨著隨后的每次傳代，細胞群變得更加均勻，因為生長速度更快的細胞占主導(dǎo)地位。也可以通過克隆從培養(yǎng)物中選出具有所需特性的細胞。

二倍體細胞系很少會超過幾個種群倍增。它們的復(fù)制能力有限，在 20 到 80 次種群倍增后開始減慢并最終停止分裂。

1. 有證據(jù)表明，在細胞培養(yǎng)中觀察到的一些細胞衰老可能是由于不適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，而不是預(yù)先確定的復(fù)制衰老。

2. 還有一些數(shù)據(jù)支持某些物種（尤其是人類）細胞的復(fù)制性衰老，即使在改進的培養(yǎng)條件下生長也是如此。這種衰老是通過每次細胞分裂時染色體末端（端粒）的縮短來介導(dǎo)的。

3. 相比之下，連續(xù)（或永生化）細胞系具有無限的復(fù)制能力。這些細胞系通過永生化或通過多種方法中的任何一種進行轉(zhuǎn)化而衍生自細胞系。許多連續(xù)細胞系來源于腫瘤組織。ATCC 集合中的大多數(shù)細胞系是連續(xù)的，但少數(shù)細胞系，例如 CCD-1117Sk 人類皮膚成纖維細胞 ( ATCC CRL-2465 ) 或 CCD-18Co 人類結(jié)腸 ( ATCC CRL-1459 ) 是有限的。

如培養(yǎng)容器部分所述，細胞系可以附著在表面（依賴錨固）或懸?。ú灰蕾囧^固）生長。當(dāng)細胞在單層或懸浮液中生長和分裂時，它們通常遵循由四個階段組成的特征性生長模式：滯后、對數(shù)或指數(shù)、靜止或平穩(wěn)期和衰退期 。

滯后期 — 接種培養(yǎng)容器后，細胞立即緩慢生長，同時從傳代培養(yǎng)的壓力中恢復(fù)。

對數(shù)期或指數(shù)期 — 細胞進入指數(shù)增長期，持續(xù)到整個生長表面被占據(jù)或細胞濃度超過培養(yǎng)基容量。

靜止期 — 細胞增殖減慢并停止。

衰退期——如果不更換培養(yǎng)基且細胞數(shù)量不減少，細胞將失去活力，數(shù)量減少。

為了確?；盍?、遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定性，細胞系需要保持在指數(shù)期。這意味著它們需要在進入穩(wěn)定生長期、單層細胞匯合之前或懸浮液達到其推薦的最大細胞密度之前定期傳代培養(yǎng)。為每個細胞系生成生長曲線有助于確定細胞系的生長特性。

蘇州阿爾法生物13年專注于實驗室儀器設(shè)備及試劑耗材行業(yè)，提供的細胞培養(yǎng)類的產(chǎn)品主要涵蓋細胞罐、生物反應(yīng)器、搖瓶、培養(yǎng)瓶、胰酶、培養(yǎng)基等幾十個品種，如需 ATCC 細胞系生長和繁殖的詳細信息，請參閱ATCC 網(wǎng)站上找到的特定細胞系產(chǎn)品表。