免疫細(xì)胞化學(xué)3D 生物打印機(jī)

概述

免疫細(xì)胞化學(xué) （ICC） 是一種實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，允許使用可在顯微鏡下可視化的選擇性探針檢測(cè)細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì)或抗原。該方案描述了使用針對(duì)特定靶標(biāo)的一抗和用熒光探針標(biāo)記的二抗的兩步ICC。以下方案針對(duì)由封裝在水凝膠中的細(xì)胞組成的3D生物打印樣品進(jìn)行了調(diào)整。

免疫細(xì)胞化學(xué)3D 生物打印機(jī)

概述

免疫細(xì)胞化學(xué) （ICC） 是一種實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，允許使用可在顯微鏡下可視化的選擇性探針檢測(cè)細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì)或抗原。該方案描述了使用針對(duì)特定靶標(biāo)的一抗和用熒光探針標(biāo)記的二抗的兩步ICC。以下方案針對(duì)由封裝在水凝膠中的細(xì)胞組成的3D生物打印樣品進(jìn)行了調(diào)整。

材料

• PBS

• PBS/0.1% Triton-X 溶液

• PBS/0.1% Triton-X/1% 牛血清白蛋白 （BSA）

• 10% 福爾馬林或 4% 多聚甲醛 （PFA）

• DAPI解決方案

• 封固劑

• 硅脂

• 顯微鏡載玻片

• 蓋玻片

方法

1. 小心地從樣品中吸出培養(yǎng)基;

2. 在 PBS x3 中洗滌 1D 生物打印結(jié)構(gòu) 5 分鐘。確保整個(gè)結(jié)構(gòu)浸入 PBS 中;

3. 在室溫下用 10% 福爾馬林或 4% PFA 固定 30 分鐘，將構(gòu)建體浸入固定劑中;

4. 在室溫下用PBS/3.0%Triton-X/1%洗滌1次15分鐘，以透化細(xì)胞膜;

5. 將一抗在 PBS/0.1% Triton-X/1% BSA 中稀釋至終濃度的樣品在 4°C 下孵育過(guò)夜;

6. 在 PBS/3.15% Triton-X 中洗滌 0 次 1 分鐘;

7. 將樣品與在PBS/0.1%Triton-X/1%BSA中稀釋的二抗在室溫下避光孵育2h;

8. 在室溫下在PBS中洗滌3次15分鐘;

9. 在PBS中將DAPI稀釋至終濃度為0.1μg/ ml至10μg/ ml，并將3D生物打印結(jié)構(gòu)浸入所得溶液中。在避光室溫下孵育 15 分鐘;

10. 在室溫下在PBS中洗滌3次15分鐘;

11. 拿一個(gè)顯微鏡載玻片，手動(dòng)擠出一些硅脂油脂，形成一個(gè)比你的3D結(jié)構(gòu)略大的孔（載玻片處理方案);

12. 將您的 3D 生物打印結(jié)構(gòu)移動(dòng)到顯微鏡載玻片上的硅膠上;

13. 將封固劑加入硅膠孔中，直至填充;

14. 將蓋玻片放在上面并輕輕按壓。硅脂不會(huì)是固體，因此請(qǐng)小心執(zhí)行此步驟;

15. 使用選定的方法進(jìn)行成像。我們建議對(duì) 3D 樣品進(jìn)行共聚焦熒光成像或雙光子顯微鏡。切記將薄蓋玻片靠近顯微鏡物鏡，以獲得更好的成像效果;

警告

根據(jù)構(gòu)建體的厚度、生物材料滲透性和幾何形狀，可能需要增加 ICC 方案的孵育時(shí)間。每個(gè)孵育時(shí)間都可以在振蕩器或軌道振蕩器上進(jìn)行，以幫助溶液的擴(kuò)散。

只有當(dāng)所使用的生物材料不透明并且可以被顯微鏡使用的光穿透時(shí)，成像才能正常工作。一些生物材料可能會(huì)顯示自發(fā)熒光并干擾成像 - 如果出現(xiàn)此問(wèn)題，請(qǐng)嘗試選擇合適的濾光片。

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