iElisa 喹乙醇檢測試劑盒

iElisa 喹乙醇檢測試劑盒

1. 概要 喹乙醇又稱喹酰胺醇，商品名為倍育諾、快育 靈，由于喹乙醇有中度至明顯的蓄積毒性，對大多 數(shù)動物有明顯致畸作用，對人也有潛在的三致性， 即致畸形，致突變，致癌。因此喹乙醇在美國和歐 盟都被禁止用作飼料添加劑?！吨袊F藥典》(2005 版)也有明確規(guī)定，喹乙醇被禁止用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng) 殖。 2. 原理 本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法檢測等樣 本中的喹乙醇，在微孔條上預(yù)包被上偶聯(lián)抗原，利 用抗原與抗體的特異性免疫化學(xué)反應(yīng)的原理來進(jìn) 行的，樣本中的喹乙醇和微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原 競爭抗喹乙醇抗體，加入酶標(biāo)記物后，用 TMB 底 物顯色，樣品中的喹乙醇含量與樣品的吸光度值呈 反比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出喹乙醇含量。 3. 試劑盒的組成 1) 包被有抗抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12條 ×8 孔） 2) 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品：0 ng/ml、0.5 ng/ml、 2.0ng/ml、5.0ng/ml、20ng/ml、50ng/ml 1 瓶 × 1.0ml 3) 喹乙醇抗體 1 瓶 ×10ml 4) 酶標(biāo)二抗 1 瓶 ×10ml 5) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50ml 6) 稀釋緩沖液A： 1 瓶 ×50ml 7) 稀釋緩沖液B： 1 瓶 ×50ml 8) 顯色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 9) 終止液： 1 瓶 × 7ml 10) 試劑盒說明書： 1 份 11) 質(zhì)檢報(bào)告： 1 份 4. 需要的儀器、試劑 1）儀器 —酶標(biāo)儀 450nm（iElisa 全自動酶標(biāo)儀或相當(dāng)者） —微量移液器：20μl-200μl 單道，100μl-1000μl 單道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋轉(zhuǎn)混合器（或者搖床、高速均質(zhì)器） —酶標(biāo)板振蕩器 —渦旋混合器 —氮?dú)獯蹈蓛x —50ml 離心管 —1.5ml 離心管 —離心機(jī) —定性濾紙 —過濾漏斗 —天平：感量 0.01g 2） 試劑 —樣品提取液 70%甲醇：取 700ml 甲醇，加 300ml 純水，混勻。 —純水（蒸餾水、去離子水）、正己烷、三氯甲烷、 甲醇 5. 樣品處理 5.1 谷物類（玉米、小麥、大麥、大米、大豆）： 1） 稱取 5.0g 粉碎(20 目過篩)的谷物類樣品于 50mL 離心管中，加入 25.0mL 純凈水提取液， 60℃水浴 10 分鐘，而后置于旋轉(zhuǎn)搖床上旋轉(zhuǎn)振 蕩提取 10 分鐘(或用高速均質(zhì)器均質(zhì) 1 分鐘， 或用手劇烈振蕩 5 分鐘)，用定性濾紙過濾。 2） 將提取液用普通濾紙過濾，吸取 100μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中，加入 400μl 稀釋緩沖液 A， 用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：25 5.2 飼料類： 1) 稱取 5.0g 粉碎(20 目過篩)的飼料樣品于 50mL 離心管中，加入 25.0mL 純凈水提取液，60℃ 水浴 10 分鐘，而后置于旋轉(zhuǎn)搖床上旋轉(zhuǎn)振蕩 提取 10 分鐘(或用高速均質(zhì)器均質(zhì) 1 分鐘，或 用手劇烈振蕩 5 分鐘)，用定性濾紙過濾。 2) 將提取液用普通濾紙過濾，取 100μl 濾液置于 1.5ml 離心管中，加入 400μl 稀釋緩沖液 B，用 渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：25 6． 酶聯(lián)免疫分析程序 6.1 測定之前注意事項(xiàng)1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 程序中的要點(diǎn)。 4) 所有溫育過程應(yīng)避免陽光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標(biāo)板。 6.2 溶液的配制 1) 提取液的配制:水要用純水、或蒸餾水、去離子 水 2) 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋 10 倍后使用。（例如：取 10 ml 濃縮液+90 ml 純 水, 可以用于 32 孔的檢測）。 6.3 測定程序 1) 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶 標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個平行實(shí)驗(yàn)，記錄 下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取 50μl 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品分別加至相應(yīng)的微孔 （雙孔）中，然后各加入 50μl 喹乙醇抗體，加 蓋，在 37℃溫育 30 分鐘（每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品 必須使用新的吸頭）。 3) 倒出孔中的液體，每孔加入 250μl 稀釋好的洗 滌液，置于酶標(biāo)板振蕩器上振蕩 30 秒鐘（或 者手工振蕩），重復(fù)操作四次。洗完后用力在 吸水紙上拍干。 4) 再加入 100μl 酶標(biāo)抗體，加蓋，37℃溫育 30 分鐘（每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新的吸頭）。 5) 倒出孔中的液體，每孔加入 250μl 稀釋好的洗 滌液，置于酶標(biāo)板振蕩器上振蕩 30 秒鐘（或 者手工振蕩），重復(fù)操作四次。洗完后用力在 吸水紙上拍干。 6) 每孔加入100μl顯色底物TMB，室溫避光溫育 10分鐘。 7) 每孔加入50μl 終止液。 8) 置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸 光度值（OD值），參比波長630nm。（iElisa全 自動酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。 7. 結(jié)果判定 1）所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的 平均值（B）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光 度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（ppb）為 X 軸，百分吸 光度值為 Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對應(yīng)每一個樣 品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方 程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件， 更便于大量樣品的快速分析。 2） 樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍 數(shù)。 3） 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用提取液進(jìn)行稀釋。 8. 注意事項(xiàng) 1) 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會導(dǎo)致數(shù)值偏低。 2) 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況， 則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn) 象。所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn) 液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。 5) 終止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要混合使 用不同批次的試劑盒，這樣會引起測定結(jié)果不 準(zhǔn)確。 7) 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。 9. 試劑盒的性能指標(biāo) 1) 檢 測 限 LOD: 谷 物 10ppb(μg/kg) ，飼料 10ppb(μg/kg)。（LOD：空白樣品測定值+2 倍標(biāo) 準(zhǔn)偏差 SD） 2) 定量限 LOQ: 谷 物 12.5ppb(μg/kg) ， 飼 料 12.5ppb(μg/kg)。 3) 定量檢測范圍：谷物 12.5-2500ppb，飼料 12.5-2500ppb。