iElisa 黃曲霉毒素總量檢測試劑盒

iElisa 黃曲霉毒素總量檢測試劑盒

1. 概要 黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的有毒的代 謝產物，主要存在于谷物、堅果和飼料中。1993 年 黃曲霉毒素 B1 被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研 究機構劃定為Ⅰ類致癌物，是一類毒性*的劇毒 物質。它被證明對人和動物的肝臟、腎臟等組織和 器官具有很大的危害。中國標準規(guī)定：黃曲霉毒素 B1 在玉米、大米、小麥中*分別不得超過 20、 10、5μ g/kg，各種飼料中黃曲霉毒素 B1 的*標 準為 10-50μ g/kg。黃曲霉毒素總量試劑盒不僅可以 對黃曲霉毒素 B1，而且可以對其他黃曲霉毒素 （B2、G1、G2）進行全面的檢測。 2. 原理 測定的基礎是抗原-抗體反應。微孔板上包被有 抗抗體。加入黃曲霉毒素 B1 標準品或樣品、酶標 抗原和抗體后，游離的黃曲霉毒素 B1、B2、G1、 G2 與酶標抗原競爭結合抗體，抗體或抗體結合物 與固定在微孔板上的抗抗體再結合，沒有結合的標 準品、酶標抗原及抗體被洗去，加入 TMB 底物顯 藍色，加入終止液后顏色由藍變黃，用酶標儀在 450nm 處檢測，吸光值與樣品中黃曲霉毒素總量含 量成負相關，與標準曲線比較即可得出黃曲霉毒素 總量的含量。 3. 試劑盒的組成 1) 包被有抗抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12 條 ×8 孔） 2) AFT 標準品：0 ng/ml、 0.25ng/ml、 0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml 1 瓶 × 1.0ml 3) AFT酶標抗原： 1 瓶 × 10ml 4) AFT抗體： 1 瓶 × 10ml 5) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50ml 6) AFT稀釋緩沖液A： 1 瓶 ×50ml 7) AFT稀釋緩沖液B： 1 瓶 ×50ml 8) 顯色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 9) 終止液： 1 瓶 × 7ml 10) 試劑盒說明書： 1 份 11) 質檢報告： 1 份 4. 需要的儀器、試劑 1）儀器 —酶標儀 450nm（iElisa 全自動酶標儀或相當者） —微量移液器：20μl-200μl 單道，100μl-1000μl 單道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋轉混合器（或者搖床、高速均質器） —酶標板振蕩器 —渦旋混合器 —氮氣吹干儀 —50ml 離心管 —1.5ml 離心管 —離心機 —定性濾紙 —過濾漏斗 —天平：感量 0.01g 2） 試劑 —樣品提取液 70%甲醇：取 700ml 甲醇，加 300ml 純水，混勻。 —純水（蒸餾水、去離子水）、正己烷、三氯甲烷、 甲醇 5. 樣品處理 5.1 谷物（玉米、小麥、大麥、大米、大豆）： 1） 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉 混合器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質器均質 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2） 將提取液用普通濾紙過濾，吸取 200μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AFT 稀釋緩沖 液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：12.5 5.2 飼料： 1) 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉 混合器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質器均 質 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2) 將提取液用普通濾紙過濾，用 0.22μm 有機系 濾膜過濾后，取 100μl 濾液置于 1.5ml 離心管中，加入 500ul AFT 稀釋緩沖液 B，用渦旋混 合器混勻。 稀釋倍數(shù)：30 5.3 植物油 1）稱取2.5g油樣品，分別加入10ml正己烷和10mL 樣品提取液（70%甲醇水），劇烈振蕩 3min（用 手或振蕩器），或搖床震蕩 10min。 2） 靜置分層，3000RPM 離心 2 分鐘。吸取 200μl 下層置于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AFT 稀 釋緩沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù): 10 倍 5.4 醬油、醋： 1） 取 5.0ml 樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 三氯甲烷置于多功能旋轉混合器上振蕩 10 分 鐘（或使用高速均質器均質 3 分鐘，或搖床上 振蕩 40 分鐘）。 2） 4000 轉離心 5 分鐘，取上層澄清溶液 5ml 與氮 氣吹干儀（60℃）吹干。加入 4ml 70%甲醇水 渦旋混勻 1 分鐘，使其充分復溶。 3） 吸取 200μl 復溶液置于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AFT 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：10 5.5 糕點： 1） 取 5.0g 樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 70% 甲醇水置于多功能旋轉混合器上振蕩 10 分鐘 （或使用高速均質器均質 3 分鐘，或搖床上振 蕩 40 分鐘）。 2） 定性濾紙過濾，取濾液 5ml 加入 10ml 三氯甲烷 渦旋 1min,4000 轉離心 5 分鐘，取下層澄清三 氯甲烷溶液 5ml 與氮氣吹干儀（60℃）吹干。 加入 2ml 70%甲醇水渦旋混勻 1 分鐘，使其充 分復溶。 3） 吸取 200μl 復溶液置于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AFT 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：10 5.6 酒類（白酒、啤酒、威士忌、櫻桃酒、葡萄酒 等） 1) 取 5.0ml 樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 三氯甲烷置于多功能旋轉混合器上振蕩 10 分 鐘（或使用高速均質器均質 3 分鐘，或搖床上 振蕩 40 分鐘）。 2) 3000 轉離心 5 分鐘，取上層澄清溶液 5ml 于氮 氣吹干儀（60℃）吹干。加入 5ml 70%甲醇水 渦旋混勻 1 分鐘，使其充分復溶。 3) 吸取 200μl 復溶液置于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AFT 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：12.5 5.7 發(fā)酵液： 1) 吸取 40μl 液體樣品置于 1.5ml 離心管中 2) 加入 960μl AFT 稀釋緩沖液 B，用渦旋混合器 混勻。 稀釋倍數(shù)：25 6． 酶聯(lián)免疫分析程序 6.1 測定之前注意事項 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 程序中的要點。 4) 所有溫育過程應避免陽光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標板。 6.2 溶液的配制 1） 提取液的配制: 根據(jù)實驗所需的量配制 70%的 甲醇水溶液（水要用純水、或蒸餾水、去離子 水） 2） 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋 10 倍 后使用。（例如：取10 ml 濃縮液+90 ml純水, 可 以用于 32 孔的檢測）。 6.3 測定程序 1) 將足夠標準品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶 標板架，標準品和樣品做兩個平行實驗，記錄 下標準和樣品的位置。未使用的酶標板用鋁箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取 50μl 標準品或樣品分別加至相應的微孔 （雙孔）中，然后各加入 50μl 的 AFT 酶標抗 原，再加入 50μl 的 AFT 抗體，加蓋，在室溫 溫育 20 分鐘（每個標準品和樣品必須使用新 的吸頭）。 3) 倒出孔中的液體，每孔加入 250μl 稀釋好的洗 滌液，置于酶標板振蕩器上振蕩 30 秒鐘（或 者手工振蕩），重復操作四次。洗完后用力在 吸水紙上拍干。 4) 每孔加入150μl顯色底物TMB，室溫避光溫育 10分鐘。 5) 每孔加入50μl 終止液。 6) 置于酶標儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸 光度值（OD值），參比波長630nm。（iElisa全 自動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值）。7. 結果判定 1) 所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值 的平均值（B）除以*個標準（0 標準）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以黃曲霉毒素 B1 標準品濃度值（ppb）為 X 軸，百分吸光度值為 Y 軸，繪制標準曲線圖。相對 應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可 以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算 機專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。 2） 樣品的實際濃度為讀數(shù)結果乘以相應稀釋倍 數(shù)。 3） 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用 70%甲醇進行稀釋。 8. 注意事項 1) 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會導致數(shù)值偏低。 2) 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況， 則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn) 象。所以洗板排干后應立即進行下一步操作。 3) 標準物質和顯色液對光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標準 液的時候都必需充分混合均勻）。 5) 終止液為強酸性物質，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要混合使 用不同批次的試劑盒，這樣會引起測定結果不 準確。 7) 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。 9. 試劑盒的性能指標 1) 檢測限 LOD: 谷物 1.5ppb(μg/kg)，飼料 4.0ppb， 植物油 1.5ppb(μg/kg)，醬油、醋 1.5ppb(μg/kg)， 糕點 1.5ppb(μg/kg)，酒類 1.5ppb(μg/kg),發(fā)酵液 3.5ppb。（LOD：空白樣品測定值+2 倍標準偏 差 SD） 2) 定量限 LOQ: 谷物 3.0ppb，飼料 7.5ppb，植物 油 2.5ppb(μg/kg)，醬油、醋 2.5ppb(μg/kg)，糕 點 2.5ppb(μg/kg)，酒類 3.0ppb，發(fā)酵液 6ppb。 3) 定量檢測范圍：谷物3.0-25ppb，飼料7.5-60ppb， 植物油 2.5-20ppb，醬油、醋 2.5-20ppb，糕點 2.5-20ppb，酒類 3.0-25ppb,發(fā)酵液 6.0-50ppb。