iElisa 伏馬毒素 B1 檢測(cè)試劑盒

iElisa 伏馬毒素 B1 檢測(cè)試劑盒

1. 概要 伏馬毒素是串珠鐮刀菌、輪狀鐮刀菌和多育鐮 刀菌等產(chǎn)生的。伏馬毒素 B1 和 B2 是自然界存在 普遍且毒性較強(qiáng)的兩種毒素。其主要存在于玉米及 玉米制品中，在大米、面條、調(diào)味品、高粱以及啤 酒中也有較低濃度的伏馬毒素存在。1993 年伏馬毒 素被癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）歸類(lèi)為 2B 類(lèi)致癌 物。 2. 原理 測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原-抗體反應(yīng)。微孔板上包被有 抗抗體。加入伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、酶標(biāo)抗原和 抗體后，游離的伏馬毒素與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗 體，抗體或抗體結(jié)合物與固定在微孔板上的抗抗體 再結(jié)合，沒(méi)有結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)抗原及抗體被洗 去，加入 TMB 底物顯藍(lán)色，加入終止液后顏色由 藍(lán)變黃，用酶標(biāo)儀在 450nm 處檢測(cè)，吸光值與樣品 中伏馬毒素含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較即可得 出伏馬毒素的含量。 3. 試劑盒的組成 1) 包被有抗抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12條 ×8 孔） 2) 伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品：0 ng/ml、2 ng/ml、 5ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、200ng/ml 1 瓶 × 1.0ml 3) Fum酶標(biāo)抗原 1 瓶 ×10ml 4) Fum抗體 1 瓶 ×10ml 5) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50ml 6) Fum稀釋緩沖液A： 1 瓶 ×50ml 7) Fum稀釋緩沖液B： 1 瓶 ×50ml 8) 顯色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 9) 終止液： 1 瓶 × 7ml 10) 試劑盒說(shuō)明書(shū)： 1 份 11) 質(zhì)檢報(bào)告： 1 份 4. 需要的儀器、試劑 1）儀器 —酶標(biāo)儀 450nm（iElisa 全自動(dòng)酶標(biāo)儀或相當(dāng)者） —微量移液器：20μl-200μl 單道，100μl-1000μl 單道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋轉(zhuǎn)混合器（或者搖床、高速均質(zhì)器） —酶標(biāo)板振蕩器 —渦旋混合器 —50ml 離心管 —1.5ml 離心管 —定性濾紙 —過(guò)濾漏斗 —天平：感量 0.01g 2） 試劑 —樣品提取液 70%甲醇：取 700ml 甲醇，加 300ml 純水，混勻。 5. 樣品處理 5.1 谷物（玉米、小麥、高粱、大米、大豆）： 1） 稱(chēng)取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn) 混合器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2） 將提取液用普通濾紙過(guò)濾，吸取 100μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中，加入 400μl Fum 稀釋緩沖 液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：25 5.2 飼料： 1) 稱(chēng)取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn) 混合器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均 質(zhì) 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2) 將提取液用普通濾紙過(guò)濾，用 0.22μm 有機(jī)系 濾膜過(guò)濾后，取 50μl 濾液置于 1.5ml 離心管中， 加入 450ul Fum 稀釋緩沖液 B，用渦旋混合器 混勻。 稀釋倍數(shù)：50 5.3 啤酒： 取 5ml 啤酒超聲 5 分鐘，取 100μl 超聲后啤酒 樣品于 1ml 離心管中，加入 900μl Fum 稀釋緩沖液 B，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：10 6． 酶聯(lián)免疫分析程序 6.1 測(cè)定之前注意事項(xiàng) 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測(cè)定 程序中的要點(diǎn)。 4) 所有溫育過(guò)程應(yīng)避免陽(yáng)光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標(biāo)板。 6.2 溶液的配制 1) 提取液的配制: 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需的量配制 70%的 甲醇水溶液（水要用純水、或蒸餾水、去離子 水） 2) 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋 10 倍后使用。（例如：取 10 ml 濃縮液+90 ml 純 水, 可以用于 32 孔的檢測(cè)）。 6.3 測(cè)定程序 1) 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶 標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄 下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取 50μl 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品分別加至相應(yīng)的微孔 （雙孔）中，然后各加入 50μl Fum 酶標(biāo)抗原， 再加入 50μl Fum 抗體，加蓋，在室溫溫育 30 分鐘（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新的吸頭）。 3) 倒出孔中的液體，每孔加入 250μl 稀釋好的洗 滌液，置于酶標(biāo)板振蕩器上振蕩 30 秒鐘（或 者手工振蕩），重復(fù)操作四次。洗完后用力在 吸水紙上拍干。 4) 每孔加入150μl顯色底物TMB，室溫避光溫育 10分鐘。 5) 每孔加入50μl 終止液。 6) 置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測(cè)定吸 光度值（OD值），參比波長(zhǎng)630nm。（iElisa全 自動(dòng)酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。 7. 結(jié)果判定 1）所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的 平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光 度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以伏馬毒素 B1 標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（ppb）為 X 軸， 百分吸光度值為 Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。相對(duì)應(yīng)每 一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出。也可以用 回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算機(jī)專(zhuān) 業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。 2） 樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍 數(shù)。 3） 如果測(cè)定值超出檢測(cè)范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用 70%甲醇進(jìn)行稀釋。 8. 注意事項(xiàng) 1) 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏低。 2) 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥過(guò)久的情況， 則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不成線(xiàn)性，重復(fù)性不好的現(xiàn) 象。所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對(duì)光敏感，避免直接暴露在 光線(xiàn)下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn) 液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。 5) 終止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，也不要混合使 用不同批次的試劑盒，這樣會(huì)引起測(cè)定結(jié)果不 準(zhǔn)確。 7) 試劑盒的儲(chǔ)存條件是2-8℃，切勿冷凍。 9. 試劑盒的性能指標(biāo) 1) 檢測(cè)限 LOD: 谷物 30ppb(μg/kg)，飼料 60ppb， 啤酒 15ppb（LOD：空白樣品測(cè)定值+2 倍標(biāo)準(zhǔn) 偏差 SD） 2) 定量限 LOQ: 谷物 50ppb，飼料 100ppb，啤酒 20ppb。 3) 定 量 檢 測(cè) 范 圍 ： 谷 物 50-5000ppb ， 飼 料 100-10000ppb，啤酒 20-2000ppb。