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利用高光譜受激拉曼散射顯微技術(shù)發(fā)現(xiàn)人類肝癌中飽和脂肪的異常積聚
閱讀：595 發(fā)布時(shí)間：2022-6-1
人類癌癥中存在脂質(zhì)代謝失調(diào)現(xiàn)象，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為不飽和脂質(zhì)的積聚會(huì)有利于腫瘤細(xì)胞存活和增殖。但目前還沒有成熟的分析工具能夠以高分辨率對(duì)未加工人體組織中的代謝物進(jìn)行識(shí)別及定量。來自華中科技大學(xué)的Shuai Yan等人使用分析性高光譜激發(fā)的拉曼散射顯微術(shù)，對(duì)24名肝癌患者的正常組織和癌性肝組織中的脂質(zhì)代謝物進(jìn)行了原位繪譜。發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)觀點(diǎn)正相反，癌性肝組織中積聚了大量的飽和脂肪，而癌性肝組織周圍的正常組織中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)這種聚集現(xiàn)象。使用質(zhì)譜進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，癌性肝臟中甘油三棕櫚酸酯含量非常高。這表明飽和脂肪的異常積累很有可能是肝癌的代謝生物標(biāo)志。該研究以“Hyperspectral Stimulated Raman Scattering Microscopy Unravels AberrantAccumulation of Saturated Fat in Human Liver Cancer“為題發(fā)表在Analytical Chemistry。
本文從24名肝細(xì)胞癌患者中收集了正常組織和癌性肝組織，并進(jìn)行高光譜SRS成像，得到飽和脂肪、不飽和脂肪、蛋白質(zhì)的拉曼圖譜。觀察分析發(fā)現(xiàn)與正常肝組織相比，癌性肝組織中飽和脂肪出現(xiàn)大量異常積聚。使用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，癌性肝組織中甘油三棕櫚酸酯(飽和脂肪的一種典型形式)的積累顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，飽和脂肪在肝癌的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，可能是肝癌診斷的潛在標(biāo)志，打破了癌細(xì)胞依靠不飽和脂肪生存和增殖的傳統(tǒng)觀點(diǎn)。
圖1b為對(duì)應(yīng)CH區(qū)域的自發(fā)拉曼光譜：在①2853 cm-1位置TP（深黃色）和TO（綠色）都出現(xiàn)CH2峰；在②2885 cm-1處只有含長直?；湹腡P出峰；④3007 cm-1位置為不飽和=CH，TO出峰；BSA在③2935 cm-1處出峰。雖然幾種物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)之間的差異很細(xì)微，但通過不同的拉曼帶可以明顯區(qū)分。
研究人員對(duì)TP、TO和BSA組成的混合物模進(jìn)行了高光譜SRS成像，使用多元曲線分辨率(m*riate curve resolution, MCR)算法重建出TP、TO和BSA的空間分布圖(圖1c)，并制作了優(yōu)化的SRS光譜(圖1d)。得到的SRS光譜保留了所有振動(dòng)拉曼帶的關(guān)鍵特征，包括TP的2885 cm-1 (②)和TO的3007 cm-1 (④)，并與自發(fā)拉曼測(cè)量的相應(yīng)光譜非常一致(圖1b)。雖然自發(fā)拉曼光譜光譜分辨率更好，因?yàn)橛懈咝阅芄鈻徘曳e分時(shí)間較長(約10秒)，但高光譜SRS特別適合對(duì)生物組織中化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行快速繪圖，能夠通過其內(nèi)在的化學(xué)振動(dòng)，對(duì)復(fù)雜生物組織中的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸進(jìn)行識(shí)別并成像。
驗(yàn)證了概念可行性后，研究人員從24名肝癌患者中獲得了癌性肝組織及其鄰近正常組織的標(biāo)本，用超光譜SRS顯微和MCR進(jìn)行分析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了三種含較為量顯著的化學(xué)成分。
圖2c-e為主要代謝成分的MCR重建濃度圖，圖2a為彩色重疊圖像，能更好地理解它們的相對(duì)空間分布。可直接觀察到有兩種類型的脂肪(黃色和綠色)在癌性肝組織中有顯著積累。圖2c為第一種類型的脂質(zhì)成分，它以不規(guī)則形狀的塊狀和液滴形式存在，對(duì)應(yīng)非常強(qiáng)的拉曼帶并在2885 cm-1處出現(xiàn)峰值，展示出飽和脂肪特征(②)，同時(shí)在3007 cm-1 (④)處的去飽和作用曲線平坦，表明反射光譜中沒有=CH振動(dòng)。圖2d為第二種脂質(zhì)濃度圖，光譜顯示不飽和脂質(zhì)特性，在3007 cm-1處有明顯的拉曼帶，主要儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)的脂滴中。MCR算法分析出的第三種化學(xué)成分為蛋白質(zhì)，光譜主要在CH3的2935 cm-1處出峰(③品紅色)，且蛋白質(zhì)在飽和脂肪（圖2c）之外的位置中分布更均勻(圖2e)。
為了更好地理解成分變化，研究人員收集了圖2c、d中五個(gè)不同位置的SRS光譜。發(fā)現(xiàn)在S1、S2和S3位置，飽和脂肪特點(diǎn)非常突出(圖2f)。其微觀形狀更接近致密的圓形脂滴(圖2c)。但S4和S5位置為飽和脂肪和不飽和脂肪的混合物。同時(shí)從形態(tài)學(xué)上看，其通常具有不規(guī)則的形狀，在濃度圖中作為大尺寸的脂質(zhì)塊存在。在圖2d不飽和脂肪的MCR重建圖像中還發(fā)現(xiàn)了不同位置的一定程度的光譜變化。在U1、U2和U3位置，展示出不飽和脂肪的特征(圖2g)。SRS濃度圖中，它們的大小較小，呈規(guī)則的圓形，可能是脂滴。然而在U4和U5位置，蛋白質(zhì)可能在空間上與不飽和脂肪重疊。后續(xù)通過計(jì)算光譜差異驗(yàn)證了這一假設(shè)。因此可以認(rèn)為這些是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的聚集體，它們也以不規(guī)則形狀的斑塊形式出現(xiàn)(圖2d)。
從上述分析結(jié)果來看，癌性肝組織中有兩種含量較多的脂質(zhì)。在脂滴中存在大量的飽和脂肪，而且有些會(huì)與不飽和脂質(zhì)混合在一起。而不飽和脂肪大多伴有細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。
為從更大面積上證實(shí)癌性肝組織確實(shí)較正常肝組織儲(chǔ)存了更多的飽和脂肪，研究人員對(duì)約500 × 500 μm2大小的癌性組織和正常組織進(jìn)行了高光譜SRS成像研究。
圖3 癌性肝組織及其周圍正常肝組織的高光譜SRS成像。（a-b）25號(hào)患者癌性組織和正常組織的圖像。黃色為飽和脂肪，綠色為不飽和脂肪，品紅色為蛋白質(zhì)。
圖3a為16幅高光譜SRS圖像及其MCR重建圖像結(jié)合生成的大比例尺濃度圖。分析發(fā)現(xiàn)在癌組織中飽和脂肪(黃色)廣泛分布，但鄰近的正常肝組織中，飽和脂肪較少(圖3b)。而且正常組織中的肝細(xì)胞組織良好，細(xì)胞形態(tài)清晰。
最后研究人員檢測(cè)了24名患者的組織樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選擇1-3個(gè)不同的位置進(jìn)行SRS成像并通過MCR重建圖像中飽和脂肪的面積進(jìn)行定量。
圖4a為每個(gè)樣本觀察區(qū)域的飽和脂肪統(tǒng)計(jì)量?？梢姲┬愿谓M織中，飽和脂肪的平均面積分?jǐn)?shù)約為12.21%，其中有兩例患者面積分?jǐn)?shù)甚至高達(dá)約40%，而在正常肝組織中僅約0.17%，即大多數(shù)正常組織檢查部位中沒有觀察到飽和脂肪積聚。隨后研究人員使用質(zhì)譜儀定量分析了11名患者的癌性肝組織和正常肝組織(圖4b)，測(cè)量了包括甘油三棕櫚酸酯(TP，16:0/16:0/16:0)、甘油三油酸酯(TO，18:1/18:1/18:1)和甘油三油酸酯(TL，18:2/18:2/18:2)在內(nèi)的脂質(zhì)含量。發(fā)現(xiàn)癌性肝組織中的TP含量確實(shí)約為正常組織的6倍，正常肝組織中不飽和脂質(zhì)包括TO和TL的水平也較高。同時(shí)在一些患者的正常肝組織中，也觀察到了含有不飽和脂肪的大尺寸脂滴。因?yàn)樵诎┙M織和正常肝組織中都觀察到不飽和脂肪，所以不飽和脂肪可能并不是癌組織所*的。而經(jīng)高光譜SRS成像和大量數(shù)據(jù)分析都發(fā)現(xiàn)，癌性肝組織中的飽和脂肪含量明顯高于正常組織，這表明飽和脂肪很有可能是肝癌代謝生物標(biāo)志物。
參考文獻(xiàn)：Yan, Shuai , et al. "Hyperspectral Stimulated Raman Scattering Microscopy Unravels Aberrant Accumulation of Saturated Fat in Human Liver Cancer." Analytical Chemistry (2018):6362.
研究背景
本文從24名肝細(xì)胞癌患者中收集了正常組織和癌性肝組織，并進(jìn)行高光譜SRS成像，得到飽和脂肪、不飽和脂肪、蛋白質(zhì)的拉曼圖譜。觀察分析發(fā)現(xiàn)與正常肝組織相比，癌性肝組織中飽和脂肪出現(xiàn)大量異常積聚。使用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，癌性肝組織中甘油三棕櫚酸酯(飽和脂肪的一種典型形式)的積累顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，飽和脂肪在肝癌的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，可能是肝癌診斷的潛在標(biāo)志，打破了癌細(xì)胞依靠不飽和脂肪生存和增殖的傳統(tǒng)觀點(diǎn)。
結(jié)果與討論
圖1b為對(duì)應(yīng)CH區(qū)域的自發(fā)拉曼光譜：在①2853 cm-1位置TP（深黃色）和TO（綠色）都出現(xiàn)CH2峰；在②2885 cm-1處只有含長直?；湹腡P出峰；④3007 cm-1位置為不飽和=CH，TO出峰；BSA在③2935 cm-1處出峰。雖然幾種物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)之間的差異很細(xì)微，但通過不同的拉曼帶可以明顯區(qū)分。
研究人員對(duì)TP、TO和BSA組成的混合物模進(jìn)行了高光譜SRS成像，使用多元曲線分辨率(m*riate curve resolution, MCR)算法重建出TP、TO和BSA的空間分布圖(圖1c)，并制作了優(yōu)化的SRS光譜(圖1d)。得到的SRS光譜保留了所有振動(dòng)拉曼帶的關(guān)鍵特征，包括TP的2885 cm-1 (②)和TO的3007 cm-1 (④)，并與自發(fā)拉曼測(cè)量的相應(yīng)光譜非常一致(圖1b)。雖然自發(fā)拉曼光譜光譜分辨率更好，因?yàn)橛懈咝阅芄鈻徘曳e分時(shí)間較長(約10秒)，但高光譜SRS特別適合對(duì)生物組織中化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行快速繪圖，能夠通過其內(nèi)在的化學(xué)振動(dòng)，對(duì)復(fù)雜生物組織中的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸進(jìn)行識(shí)別并成像。
驗(yàn)證了概念可行性后，研究人員從24名肝癌患者中獲得了癌性肝組織及其鄰近正常組織的標(biāo)本，用超光譜SRS顯微和MCR進(jìn)行分析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了三種含較為量顯著的化學(xué)成分。
圖2c-e為主要代謝成分的MCR重建濃度圖，圖2a為彩色重疊圖像，能更好地理解它們的相對(duì)空間分布。可直接觀察到有兩種類型的脂肪(黃色和綠色)在癌性肝組織中有顯著積累。圖2c為第一種類型的脂質(zhì)成分，它以不規(guī)則形狀的塊狀和液滴形式存在，對(duì)應(yīng)非常強(qiáng)的拉曼帶并在2885 cm-1處出現(xiàn)峰值，展示出飽和脂肪特征(②)，同時(shí)在3007 cm-1 (④)處的去飽和作用曲線平坦，表明反射光譜中沒有=CH振動(dòng)。圖2d為第二種脂質(zhì)濃度圖，光譜顯示不飽和脂質(zhì)特性，在3007 cm-1處有明顯的拉曼帶，主要儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)的脂滴中。MCR算法分析出的第三種化學(xué)成分為蛋白質(zhì)，光譜主要在CH3的2935 cm-1處出峰(③品紅色)，且蛋白質(zhì)在飽和脂肪（圖2c）之外的位置中分布更均勻(圖2e)。
為了更好地理解成分變化，研究人員收集了圖2c、d中五個(gè)不同位置的SRS光譜。發(fā)現(xiàn)在S1、S2和S3位置，飽和脂肪特點(diǎn)非常突出(圖2f)。其微觀形狀更接近致密的圓形脂滴(圖2c)。但S4和S5位置為飽和脂肪和不飽和脂肪的混合物。同時(shí)從形態(tài)學(xué)上看，其通常具有不規(guī)則的形狀，在濃度圖中作為大尺寸的脂質(zhì)塊存在。在圖2d不飽和脂肪的MCR重建圖像中還發(fā)現(xiàn)了不同位置的一定程度的光譜變化。在U1、U2和U3位置，展示出不飽和脂肪的特征(圖2g)。SRS濃度圖中，它們的大小較小，呈規(guī)則的圓形，可能是脂滴。然而在U4和U5位置，蛋白質(zhì)可能在空間上與不飽和脂肪重疊。后續(xù)通過計(jì)算光譜差異驗(yàn)證了這一假設(shè)。因此可以認(rèn)為這些是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的聚集體，它們也以不規(guī)則形狀的斑塊形式出現(xiàn)(圖2d)。
從上述分析結(jié)果來看，癌性肝組織中有兩種含量較多的脂質(zhì)。在脂滴中存在大量的飽和脂肪，而且有些會(huì)與不飽和脂質(zhì)混合在一起。而不飽和脂肪大多伴有細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。
為從更大面積上證實(shí)癌性肝組織確實(shí)較正常肝組織儲(chǔ)存了更多的飽和脂肪，研究人員對(duì)約500 × 500 μm2大小的癌性組織和正常組織進(jìn)行了高光譜SRS成像研究。
圖3 癌性肝組織及其周圍正常肝組織的高光譜SRS成像。（a-b）25號(hào)患者癌性組織和正常組織的圖像。黃色為飽和脂肪，綠色為不飽和脂肪，品紅色為蛋白質(zhì)。
圖3a為16幅高光譜SRS圖像及其MCR重建圖像結(jié)合生成的大比例尺濃度圖。分析發(fā)現(xiàn)在癌組織中飽和脂肪(黃色)廣泛分布，但鄰近的正常肝組織中，飽和脂肪較少(圖3b)。而且正常組織中的肝細(xì)胞組織良好，細(xì)胞形態(tài)清晰。
最后研究人員檢測(cè)了24名患者的組織樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選擇1-3個(gè)不同的位置進(jìn)行SRS成像并通過MCR重建圖像中飽和脂肪的面積進(jìn)行定量。
圖4a為每個(gè)樣本觀察區(qū)域的飽和脂肪統(tǒng)計(jì)量?？梢姲┬愿谓M織中，飽和脂肪的平均面積分?jǐn)?shù)約為12.21%，其中有兩例患者面積分?jǐn)?shù)甚至高達(dá)約40%，而在正常肝組織中僅約0.17%，即大多數(shù)正常組織檢查部位中沒有觀察到飽和脂肪積聚。隨后研究人員使用質(zhì)譜儀定量分析了11名患者的癌性肝組織和正常肝組織(圖4b)，測(cè)量了包括甘油三棕櫚酸酯(TP，16:0/16:0/16:0)、甘油三油酸酯(TO，18:1/18:1/18:1)和甘油三油酸酯(TL，18:2/18:2/18:2)在內(nèi)的脂質(zhì)含量。發(fā)現(xiàn)癌性肝組織中的TP含量確實(shí)約為正常組織的6倍，正常肝組織中不飽和脂質(zhì)包括TO和TL的水平也較高。同時(shí)在一些患者的正常肝組織中，也觀察到了含有不飽和脂肪的大尺寸脂滴。因?yàn)樵诎┙M織和正常肝組織中都觀察到不飽和脂肪，所以不飽和脂肪可能并不是癌組織所*的。而經(jīng)高光譜SRS成像和大量數(shù)據(jù)分析都發(fā)現(xiàn)，癌性肝組織中的飽和脂肪含量明顯高于正常組織，這表明飽和脂肪很有可能是肝癌代謝生物標(biāo)志物。
研究小結(jié)
參考文獻(xiàn)：Yan, Shuai , et al. "Hyperspectral Stimulated Raman Scattering Microscopy Unravels Aberrant Accumulation of Saturated Fat in Human Liver Cancer." Analytical Chemistry (2018):6362.
高光譜顯微系統(tǒng)
作為一種新穎的表征手段，高光譜系統(tǒng)正逐漸在多個(gè)領(lǐng)域嶄露頭角。IMA高光譜顯微鏡具有優(yōu)異的光譜和空間分辨率。在掃描樣品光譜的同時(shí)繪制圖像。支持明場、暗場成像等多種成像模式，還可以結(jié)合拉曼光譜生成空間圖像，滿足不同材料的研究需求。
1.高通量面掃分光系統(tǒng)，能夠更快地獲取數(shù)據(jù)。包含當(dāng)前視野范圍內(nèi)材料的一切光譜信息，可選擇任意波長生成單色圖，也可以選取任意一點(diǎn)抽取光譜。
2.濾光損耗極低(10%)。通過精確控制濾光角度，使成像范圍橫跨數(shù)百納米，覆蓋了可見光及近紅外光區(qū)，光譜分辨率達(dá)5納米以內(nèi)。
3.全局成像技術(shù)——對(duì)視野中樣品面掃成像，極大提升了掃描速度。在均勻照明系統(tǒng)的幫助下，能有效減少光源單點(diǎn)聚焦造成的樣品損傷。