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視覺研究中，視網(wǎng)膜疾病的小動(dòng)物模型非常重要，無創(chuàng)高分辨率的體內(nèi)鼠視網(wǎng)膜成像是該領(lǐng)域應(yīng)用的重要工具。加拿大研究人員Yifan Jian等介紹了一種用于小鼠體內(nèi)視網(wǎng)膜高分辨率成像的定制傅里葉域光學(xué)相干斷層成像（FD-OCT）設(shè)備。為了克服小鼠眼畸變，在折射FD-OCT系統(tǒng)的采樣臂中引入一個(gè)商用自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)。使用折射抵消透鏡減少了角膜的低階像差和鏡面反射。文章還描述了一種用于修正小鼠眼殘余波前像差的自適應(yīng)光學(xué)（adaptive optics, AO）系統(tǒng)的性能，展示了有無AO校正的活體內(nèi)AO FD-OCT圖像。體內(nèi)成像結(jié)果表明視網(wǎng)膜圖像中毛細(xì)血管和神經(jīng)纖維束的亮度和對比度得到了改善。文章以“Adaptive optics optical coherence tomography for in vivo mouse retinalimaging"為題發(fā)表于J BIOMED OPT。

 

背景
 

人類疾病的小動(dòng)物模型是現(xiàn)代視覺研究的重要組成部分。嚙齒動(dòng)物（如小鼠和大鼠）通常用于開發(fā)對抗致盲疾病的新療法。為了更好地觀察細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)、了解活體視網(wǎng)膜的分子過程，需要對嚙齒動(dòng)物眼睛進(jìn)行高分辨率視網(wǎng)膜成像。免疫組織學(xué)等技術(shù)可作為視網(wǎng)膜研究的金標(biāo)準(zhǔn)，但只能研究單個(gè)時(shí)間點(diǎn)，還可能需要使用許多動(dòng)物。而無創(chuàng)成像使研究單個(gè)動(dòng)物在治療過程中的動(dòng)態(tài)過程和反應(yīng)成為可能。
 

對于活體內(nèi)眼成像，獲得細(xì)胞級分辨率通常需要大瞳孔及自適應(yīng)光學(xué)（AO）實(shí)現(xiàn)。AO能夠校正眼睛折射表面引起的像差，實(shí)現(xiàn)衍射極限的橫向分辨率。使用AO結(jié)合眼底攝影、OCT和共焦掃描激光眼底鏡，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了人感光器馬賽克的可視化。已知視力良好的年輕健康志愿者在適當(dāng)瞳孔大?。?-4mm以下），不使用OA的情況下，可觀察到從中央凹偏心2°的錐狀馬賽克。然而接近中央凹處的錐狀或棒狀感光器密度要高得多，因此要想提高分辨率并使這些結(jié)構(gòu)可視化，就需要大瞳孔尺寸和AO校正。
 

小鼠眼睛大小約為人類的1/8，但其數(shù)值孔徑（NA）是人類的2倍以上。而光學(xué)像差對圖像質(zhì)量的影響隨著NA的增加而增加，這阻礙了小鼠體內(nèi)高分辨率成像。為此科學(xué)家們做了很多補(bǔ)償相差嘗試：Biss等人的AO生物顯微鏡和Alt等人用于小鼠視網(wǎng)膜活體成像的AO SLO表明，AO校正單色像差提高了圖像的亮度和分辨率；Geng等人證明當(dāng)一個(gè)引發(fā)長聚焦深度的小直徑波前信標(biāo)入射到小鼠視網(wǎng)膜上時(shí)，Hartmann-Shack波前傳感器（WFS）中出現(xiàn)了一個(gè)雙斑點(diǎn)，而他們最新的AO共焦掃描激光檢眼鏡（cSLO）在活體小鼠視網(wǎng)膜中shouci觀察到了光感受器馬賽克。

與en face成像方式的cSLO相比，OCT的優(yōu)勢在于能夠獲得視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的橫截面圖像，這一特性使得嚙齒動(dòng)物縱向研究成為可能。除結(jié)構(gòu)信息外，OCT功能擴(kuò)展（如多普勒OCT和血流對比OCT）還能可視化血管網(wǎng)絡(luò)。
 

OCT圖像的質(zhì)量在很大程度上受焦點(diǎn)大小、掃描長度、采樣密度影響，OCT B-scan平均技術(shù)也會(huì)影響散斑（相干噪聲）的尺寸和對比度。臨床OCT平均圖像質(zhì)量的提高通常是通過斑點(diǎn)圖案的模糊來實(shí)現(xiàn)，因此橫向分辨率降低了2/3或更多。
 

本研究旨在探討提高OCT對小鼠視網(wǎng)膜成像的橫向分辨率的方法。研究人員將外目標(biāo)透鏡與折射抵消眼底透鏡結(jié)合以減少小鼠眼像差，利用該技術(shù)，在小鼠視網(wǎng)膜體內(nèi)成像過程中，可以通過增加NA來減小斑點(diǎn)的大小。為了確保光斑尺寸（橫向分辨率）的改善不會(huì)被因像差增加而產(chǎn)生的斑點(diǎn)模糊而抵消，將自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)集成到小鼠視網(wǎng)膜OCT成像儀中。使其能夠監(jiān)測并校正折射誤差，從而改善聚焦光斑尺寸。體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，可以觀察到橫向分辨率增加及散斑尺寸減小。
 

圖1 小動(dòng)物AO FD-OCT系統(tǒng)示意圖。
 

 

結(jié)果
 

將麻醉小鼠的眼睛對準(zhǔn)眼底透鏡，通過軸向平移眼底透鏡和小鼠進(jìn)行適度調(diào)焦（圖1）。由于FD-OCT和波前傳感器（WFS）使用同一光源，通過觀察B-scan調(diào)整焦平面在小鼠視網(wǎng)膜上的位置，可以監(jiān)測對WFS斑點(diǎn)的影響。圖2為來自WFS相機(jī)的代表性圖像，其中DM保持在推薦的“平坦"位置。圖2(a)數(shù)據(jù)在焦點(diǎn)未優(yōu)化時(shí)獲得，B-scan中整個(gè)視網(wǎng)膜厚度普遍明亮，波前斑點(diǎn)較大。仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)波前斑點(diǎn)中有兩個(gè)峰值，與已報(bào)道結(jié)果相似。圖2(b)中的WFS數(shù)據(jù)是調(diào)整外視網(wǎng)膜上的焦點(diǎn)位置后獲得。放大視圖中，WFS點(diǎn)似乎變得更圓，并且只包含一個(gè)單峰，這對于質(zhì)心檢測和AO像差校正算法非常重要。在相應(yīng)的同時(shí)獲得的B-scan中，與圖2(a)相比，視網(wǎng)膜外層的強(qiáng)度高于視網(wǎng)膜內(nèi)層。
 

圖2 WFS相機(jī)圖像及相同位置同時(shí)獲取的相應(yīng)對數(shù)標(biāo)度B-scan。熱圖中一個(gè)WFS點(diǎn)（紅色虛線圓圈中）以較高的放大率顯示，在黑線位置提取相應(yīng)的強(qiáng)度分布。（a）具有非優(yōu)化焦點(diǎn)的WFS圖像。（b）優(yōu)化光束聚焦于視網(wǎng)膜外層獲得的WFS圖像。
 

 

圖3(b-d)為成像期間，WFS在AO校正前后記錄的均方根誤差和Zernike系數(shù)測量值。在AO校正前，將小鼠眼睛沿光軸對齊，焦點(diǎn)設(shè)置在外視網(wǎng)膜。AO校正前的均方根誤差在0.2-0.6 μm范圍內(nèi)，以散焦和散光為主。激活A(yù)O校正后，均方根波前誤差降低到50 nm左右。繪制了8只小鼠（僅右眼）校正前后每個(gè)Zernike系數(shù)的平均幅度（平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差），展示系統(tǒng)性能（圖3e）。
 

圖3（a）用紙模在視網(wǎng)膜平面上測量系統(tǒng)殘余像差。（b）小鼠成像過程中RMS波前誤差的代表性軌跡。用AO FD-OCT成像小鼠視網(wǎng)膜時(shí)，（c）AO校正前和（d）校正過程中測得的相應(yīng)Zernike系數(shù)。（e）對8只小鼠樣本測量校正前后Zernike系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差的平均值。
 

 

圖4為小鼠視網(wǎng)膜定制標(biāo)準(zhǔn)分辨率FD-OCT系統(tǒng)的代表性圖像，以及來自具有類似光源（軸向分辨率）的AO FD-OCT系統(tǒng)圖像。有文獻(xiàn)也描述了用于獲取這些圖像的標(biāo)準(zhǔn)橫向分辨率嚙齒動(dòng)物FD-OCT系統(tǒng)的光學(xué)系統(tǒng)。簡而言之，系統(tǒng)的高斯束腰(1∕e²)約6.5μm、焦深約308μm（足以容納小鼠視網(wǎng)膜的全部厚度）。標(biāo)準(zhǔn)分辨率FD-OCT圖像的采集和處理與AO FD-OCT系統(tǒng)圖像保持一致。圖5中的標(biāo)準(zhǔn)分辨率B-scan由1.5 mm橫向掃描長度獲得。所有主要的視網(wǎng)膜層都可以在圖像中識別，且似乎都是明亮的。黃色虛線框中的插圖由AO FD-OCT系統(tǒng)獲得，所用小鼠與標(biāo)準(zhǔn)分辨率FD-OCT系統(tǒng)成像所用小鼠相同品系。插圖中，與標(biāo)準(zhǔn)分辨率FD-OCT圖像相比，AO FDOCT光束聚焦在比視網(wǎng)膜內(nèi)層更亮的視網(wǎng)膜外層。如預(yù)期，AO FD-OCT圖像中觀察到的斑點(diǎn)尺寸明顯小于標(biāo)準(zhǔn)分辨率FD-OCT圖像中的，從而增強(qiáng)了視網(wǎng)膜層的可見性。
 

圖4 普通嚙齒動(dòng)物OCT B-scan與高分辨率AO-OCT B-scan（AO-ON采集黃色虛線框內(nèi)）的比較。圖像均來自C57BL/6J（色素沉著）小鼠，由20次運(yùn)動(dòng)校正B-scan平均產(chǎn)生。數(shù)據(jù)均采用對數(shù)強(qiáng)度標(biāo)度。AO FD-OCT插圖上看到的斑點(diǎn)尺寸較小。比例尺100μm。
 

 

為了可視化AO系統(tǒng)對B-scan的影響，在AO系統(tǒng)關(guān)閉和打開的情況下，對同一視網(wǎng)膜位置采集了幾組數(shù)據(jù)，并用線性強(qiáng)度標(biāo)度顯示結(jié)果。圖5(a)為AO系統(tǒng)關(guān)閉（OFF）時(shí)的圖像（flat DM），物鏡焦點(diǎn)在外視網(wǎng)膜上。圖5(b)為AO開啟（ON）時(shí)聚焦于外視網(wǎng)膜的B-scan，圖5(c)為聚焦于內(nèi)視網(wǎng)膜的B-scan。AO校正激活（AO-ON）時(shí)，B-scan更亮（圖5右）。例如當(dāng)AO被激活并聚焦在外視網(wǎng)膜時(shí)，OLM的測量強(qiáng)度增加了約3倍（圖5a和b）。焦點(diǎn)偏移的效果可以通過圖5(b和c)中相應(yīng)視網(wǎng)膜層的強(qiáng)度變化來觀察。
 

圖5 相同偏心率下獲得的C57BL/6J（色素沉著）小鼠視網(wǎng)膜體內(nèi)OCT B-scan圖像（左），及深度-強(qiáng)度曲線（右）。（a）AO關(guān)閉時(shí)（DM flat）獲取，（b）AO激活并將焦點(diǎn)設(shè)置在外視網(wǎng)膜時(shí)獲取，（c）AO激活并通過AO軟件將焦點(diǎn)轉(zhuǎn)移到內(nèi)視網(wǎng)膜時(shí)獲取。圖像（a）、（b）和（c）通過平均20次B-scan生成，并以線性強(qiáng)度標(biāo)度呈現(xiàn)。比例尺50μm。
 

 

激活A(yù)O系統(tǒng)后，可以通過改變AO控制軟件中的離焦量來調(diào)整焦平面位置。在小鼠視網(wǎng)膜的B-scan圖像中，可以實(shí)時(shí)觀察到焦平面位置的變化，因?yàn)榻蛊矫嫔细鲗拥牧炼蕊@著增加。從光柵掃描獲得的AO FD-OCT體積式圖中提取小鼠視網(wǎng)膜的en face圖像，垂直疊加的B-scan幀間距為0.6μm。圖6為視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層（RNFL）、內(nèi)網(wǎng)狀層（IPL）和外網(wǎng)狀層（OPL）的代表性圖像。橫截面圖像中括號所示為聚焦層及創(chuàng)建en face圖像所需的像素范圍。在同一位置采集四組體積式數(shù)據(jù)，用相同參數(shù)進(jìn)行后處理，并在相同的線性強(qiáng)度標(biāo)度上呈現(xiàn)。黃色虛線框中的圖像數(shù)據(jù)沿短軸平均，以生成右側(cè)的強(qiáng)度圖（藍(lán)色線表示AO-ON，紅色虛線表示AO-OFF）。AO激活后RNFL中神經(jīng)纖維以及IPL和OPL中毛細(xì)血管的銳度和亮度得到改善（圖7）。在AO-OFF情況下，只有OPL（圖6f）具有足夠的對比度以使得能夠與對應(yīng)的AO-ON圖像（圖6c）進(jìn)行比較，右欄的線形圖形中可觀察到毛細(xì)血管強(qiáng)度有2-3倍的增加。
 

圖6 用AO FD-OCT系統(tǒng)體內(nèi)獲得的小鼠視網(wǎng)膜橫截面圖像。通過改變AO控制軟件中的離焦量，將焦平面設(shè)置在視網(wǎng)膜內(nèi)部。B-scan中括號所示的軸向深度代表不同視網(wǎng)膜層的en face投影，分為AO-ON時(shí)（a-c）和AO-OFF（DM平面）時(shí)（d-f）。比例尺30μm。
 

 

圖7顯示了與圖6所示不同的動(dòng)物視網(wǎng)膜圖像?？梢暬瞬煌拿?xì)血管叢層和感光層（PRL），可見強(qiáng)度和分辨率提高（視網(wǎng)膜毛細(xì)血管寬度提高）。圖7(c和g)中的綠色虛線框表示在AO打開和關(guān)閉的情況下測量幾個(gè)不同尺寸毛細(xì)血管寬度的位置。相應(yīng)的折線圖已標(biāo)準(zhǔn)化（圖7底部1、2和3）。平均而言，用AO-ON測量的毛細(xì)血管直徑比AO關(guān)閉時(shí)約窄2.5×。
 

圖7 用AO FD-OCT系統(tǒng)體內(nèi)獲得的小鼠視網(wǎng)膜截面和en face圖像（IPL、INL、OPL和PRL）。通過改變AO控制軟件中的離焦，在感興趣層上調(diào)整焦平面，如B-scan圖像中的紅色括號。B-scan中括號所示的軸向深度分別表示AO-ON（a-d）和AO-OFF（DM平面）（e-h）時(shí)同一位置不同視網(wǎng)膜層的en face投影的位置。底部為c和g中標(biāo)記1、2和3的位置處毛細(xì)血管圖像強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)化線圖。比例尺30μm。
 

 

結(jié)論與討論
 

本文介紹了一種用于小動(dòng)物視網(wǎng)膜成像的AO FD-OCT系統(tǒng)，系統(tǒng)使用同一光源做成像光源和波前傳感光源。為了便于小鼠成像，使用眼底透鏡幫助對齊閉并消除角膜屈光。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠視網(wǎng)膜圖像中毛細(xì)血管和神經(jīng)纖維束的亮度和對比度得到了改善。

 

自適應(yīng)光學(xué)視網(wǎng)膜成像的關(guān)鍵是精確的波前感知。對于小動(dòng)物如鼠，尤其具有挑戰(zhàn)性。本文AO FD-OCT系統(tǒng)的設(shè)計(jì)特點(diǎn)之一是使用了眼底透鏡消除空氣-角膜界面的折射，而不是用物鏡聚焦光。該方式通過組合移動(dòng)眼底透鏡和眼睛，使光可以很容易地聚焦在外視網(wǎng)膜上，從而獲得單峰高質(zhì)量的波前圖像。此外，通過使用單一光束進(jìn)行波前傳感和FD-OCT，能夠通過觀察B-scan實(shí)時(shí)監(jiān)測成像光束聚焦的視網(wǎng)膜區(qū)域。由于被成像的眼睛與眼底晶狀體接觸，有效減少了角膜干燥和混濁。使用物鏡將光聚焦在視網(wǎng)膜上可能會(huì)使產(chǎn)生圖像平面的曲率場與小鼠視網(wǎng)膜的曲率不匹配，但本文不存在這個(gè)問題，因?yàn)锳O FD-OCT掃描的區(qū)域很小，如圖5-7中的B-scan圖像所示，視網(wǎng)膜表面在短距離內(nèi)是平坦的。

 

當(dāng)前的系統(tǒng)設(shè)計(jì)中，沒有使用小鼠眼球的全部NA。預(yù)計(jì)分辨率需要提高兩倍才能用高對比度來分辨橫截面圖像和en face圖像中完整的光感受器馬賽克。與cSLO不同，OCT的軸向分辨率取決于光源的帶寬；為了獲得超高的軸向分辨率，需要很寬的光譜帶寬。這給AO-OCT帶來了額外的挑戰(zhàn)，因?yàn)殡S著光譜變寬，色差將開始影響光斑大小。需要進(jìn)一步詳細(xì)研究這些色差的影響，以利用小鼠眼睛的完整NA。此外，焦點(diǎn)的深度與光斑的大小相耦合；光斑尺寸較小會(huì)使焦點(diǎn)深度非常小，小于PRLs厚度。所幸OCT靈敏度非常高，離焦結(jié)構(gòu)仍然可見，但強(qiáng)度和分辨率降低。

未來研究需要提高系統(tǒng)的分辨率和聚焦深度。首先使修改屈光性AO系統(tǒng)，以便通過更大的瞳孔大小對小鼠進(jìn)行成像，從而提高可實(shí)現(xiàn)的理論橫向分辨率。此外在嚙齒動(dòng)物AO-OCT系統(tǒng)中加入SLO成像通道（類似Zawadzki等人提出的人視網(wǎng)膜成像設(shè)計(jì)），將允許使用光遺傳學(xué)中的新型熒光分子探針，從小鼠體內(nèi)同時(shí)獲得結(jié)構(gòu)和潛在功能數(shù)據(jù)。另外在不犧牲AO提供的橫向分辨率的情況下，探究延長AO-FDOCT系統(tǒng)聚焦深度的方法。已知幾種可能的高NA OCT成像解決方案，包括使用動(dòng)態(tài)聚焦、實(shí)現(xiàn)貝塞爾光束成像或在AO-OCT系統(tǒng)中引入附加像差等。最終的目標(biāo)是利用自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)提高橫向分辨率，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)光感受器的細(xì)胞級分辨率成像。
 

參考文獻(xiàn)：Jian, Y. ,  R. J. Zawadzki , and  M. V. Sarunic . "Adaptive optics optical coherence tomography for in vivo mouse retinal imaging." Journal of Biomedical Optics 18(2013).