流式樣品中不可能*去除死細胞，而在流式分析時又不希望有死細胞的干擾，所以如何在流式分析和流式分選時明確分辨死細胞就成為流式細胞術的一個重要研究內(nèi)容。目前，有四種方法供流式分析者區(qū)分死細胞和活細胞。
活細胞能產(chǎn)生非特異性熒光，只是非特異性熒光信號相對于熒光素發(fā)射的熒光信號較弱。死細胞也可以產(chǎn)生非特異性熒光，而且死細胞產(chǎn)生的非特異性熒光要明顯強于活細胞，有的甚至強于熒光素產(chǎn)生的熒光信號。非特異性熒光產(chǎn)生的熒光波長沒有選擇性，并不是局限于某一熒光波長范圍，而是處于連續(xù)的波長范圍，所以一般所有的熒光通道都能夠接收到死細胞產(chǎn)生的非特異性熒光信號，而且其在所有波長范圍的熒光強度相差不多，各個熒光通道接收到的死細胞的熒光強度都是處于同一個等級的。在散點圖上死細胞是位于對角線上的，而且不同的死細胞，其非特異性熒光的強度不同，且差異可能很大，強度大的可能是強度小的幾十倍，甚至幾百倍。所以從整體來看，死細胞的非特異性熒光強度呈現(xiàn)出從低到高的連續(xù)性分布，表現(xiàn)在散點圖上死細胞剛好處于對角線上，如圖A所示呈線型，與活細胞群體的圓形分布有明顯區(qū)別。流式分析者可以根據(jù)死細胞的這一特點區(qū)分活細胞和死細胞。死細胞位于散點圖的對角線上，但是對角線上的細胞卻并不一定都是死細胞，因為雙陽性細胞如果在x軸和y軸的熒光信號相似時，也可以位于對角線上。所以，散點圖對角線上的細胞可能是死細胞，也可能是雙陽性細胞，但是這兩種細胞的形狀是不一樣的，死細胞呈現(xiàn)連續(xù)的線型分布，而雙陽性細胞群呈現(xiàn)圓形的群體分布，可以從對角線上的細胞群體的形狀大致判斷細胞的性質(zhì)。圓形的雙陽性細胞群和線型的死細胞群有時相互重合在一起，這時依靠散點圖無怯區(qū)分雙陽性細胞和死細胞。如圖B所示，樣品細胞為正常小鼠脾臟細胞，標記FITC抗CD3抗體和PE抗CD4抗體，FITC和PE雙陽性的CD4+T細胞與死細胞也在一起，無法區(qū)分。如上所述，死細胞的非特異性熒光強度可以與熒光素產(chǎn)生的熒光強度類似，所以不能根據(jù)熒光強度的強弱去區(qū)分該熒光信號是來自于死細胞的非特異性熒光還是來自于熒光素產(chǎn)生的熒光，但是可以利用在散點圖上死細胞位于對角線的特點來區(qū)分死細胞和陽性的活細胞。散點圖可以同時反映兩個熒光通道的信息，如果X軸代表的通道是標記的熒光素接收通道，而y軸代表的通道是不標記熒光素的通道，即閑置熒光通道，這時死細胞和X軸代表的熒光素陽性細胞在X軸的熒光信號可能相同，單從這個熒光通道信號無法區(qū)分，但是可以從散點圖中細胞y軸信號的大小來區(qū)分，死細胞的X軸和y軸熒光信號相似，位于對角線上，而陽性細胞y軸代表的信號是陰性的，X軸代表的信號是陽性的，位于散點圖的右下區(qū)域，即位于對角線死細胞的右下方，死細胞和陽性活細胞可以被明顯區(qū)分。如圖C所示，X軸表示FITC通道（樣品細胞標記有FITC抗CD3抗體）、y軸表示APC通道（閑置通道），借用該散點圖可以明確區(qū)分圖B中無法區(qū)分的死細胞和雙陽性細胞。此時只需將排除了死細胞后的CD3+T細胞設門，將門內(nèi)的細胞顯示于新的FITC-PE散點圖中，如圖D所示，此時該散點圈內(nèi)的細胞都是活細胞，因為樣品細胞同時標記有PE抗CD4抗體，所以圖中的細胞明顯分為兩群，雙陽性的是CD4+T細胞，單陽性的是CD8+T細胞。7AAD(7氨基放線菌素D）是一種經(jīng)典的核酸標記染料，在流式細胞術中能夠代替PI染料用于標記死細胞，以去除死細胞對于實驗結(jié)果的影響。PI染料被激發(fā)后發(fā)射的熒光波長范圍很大，常規(guī)FL1、FL2,FL3都能夠接收到其熒光信號，所以與FITC和PE熒光素發(fā)射的熒光波長有很大程度的重疊，因此，PI染料不宜與FITC和PE共標記。而同樣標記核酸的7AAD，其發(fā)射的熒光波長比較集中，一般被PerCP熒光通道接收，基本不與FITC和PE發(fā)射的熒光重疊，可以與FITC和PE共同標記樣品細胞。所以，7AAD在標記死細胞方面要明顯優(yōu)于PI染料。7AAD的熒光信號被PerCP通道接收，所以7AAD不能與PerCP或PE-Cy5偶聯(lián)的抗體共同標記樣品細胞。標記7AAD不需要與其他熒光素偶聯(lián)抗體同時標記，只需在流式上樣前5min加入適量的7AAD于流式管中，就可上樣分析。分析時將PerCP通道陰性的細胞設門顯示于新的流式圖中即可，此時流式圖中的細胞都是7AAD陰性的活細胞。PE-Cy5通道（通常是FL3，接收的熒光波長范圍大致為655-685nm)有時可用于識別死細胞，但首先該通道必須是閑置通道，即樣品細胞中沒有標記該通道代表的熒光素（PE-Cy5、PerCP等）偶聯(lián)抗體。選擇PE-Cy5-SSC散點圖，一般可看到不成群的PE-Cy5陽性細胞，這些陽性細胞的SSC值也是散在分布的，這些散在的PE-Cy5通道非標記陽性細胞一般都是死細胞，如下圖所示。PE-Cy5通道非標記陽性細胞，即圖A中的設門部分，將這部分細胞設門顯示于FITC-PE散點圈中，如圖B所示，這部分PE-Cy5通道非標記陽性細胞基本都位于對角線部分，而對角線細胞一般就是死細胞，所以，散在的PE-Cy5通道非標記陽性細胞一般就是死細胞。利用PE-Cy5通道非標記陽性細胞區(qū)分活細胞和死細胞時，流式圖分析的順序一般是先在FSC-SSC圖中選擇目標細胞所在的細胞群，將其設門，然后將門內(nèi)的細胞顯示于PE-Cy5-SSC散點圈中，排除PE-Cy5通道非標記陽性細胞代表的死細胞，將PE-Cy5陰性細胞設門，然后將門內(nèi)的細胞顯示于新的流式圖內(nèi)分析，這時該流式圖內(nèi)的細胞都是活細胞，分析或者分選時就可以盡量排除死細胞的干擾了。但是，這種排除死細胞的方法只是一種經(jīng)驗方法，一般在實驗要求不高或者預實驗時使用，PE-Cy5通道非標記陽性細胞并不一定都是死細胞，死細胞也并不一定都位于PE-Cy5通道非標記陽性區(qū)域內(nèi)，其陰性區(qū)域內(nèi)也可能有一定比例的死細胞。所以，流式分析者可以借鑒這種方法區(qū)分死細胞和活細胞，但是不能將此方提作為區(qū)分死細胞和活細胞的金標準，7AAD標記法才是標記死細胞的金標準。只標記分析活細胞的表面抗原分子時，用7AAD鑒別死細胞和活細胞是理想且經(jīng)典的方法。但是如果分析胞內(nèi)分子，如檢測胞內(nèi)的重要抗原分子、胞內(nèi)細胞因子和胞內(nèi)活化的激酶等都需要先固定樣品細胞，然后用打孔劑在細胞膜上打孔，使熒光素偶聯(lián)抗體能夠通過細胞膜進入細胞內(nèi)，與相應目標分子結(jié)合，這時7AAD就無怯鑒別死細胞和活細胞了。如果在固定細胞前標記7AAD，固定和打孔的過程可能會使7AAD發(fā)射熒光的能力丟失，如果在上樣前標記7AAD，那所有的細胞都會被標記，因為7AAD也可經(jīng)過小孔進入細胞內(nèi)部與DNA結(jié)合。這時，就可以用EMA(ethidiummonoazaide)和胺反應性活性染料(aminereactiveviability dye,ViD)代替7AAD在分析胞內(nèi)分子時用于鑒別死細胞和活細胞。EMA與PI和7AAD一樣也是一種能夠與DNA結(jié)合的熒光染料，但不能自由通過活細胞的細胞膜，當細胞死亡細胞膜通透性增加時就可以進入細胞內(nèi)與DNA結(jié)合。EMA比PI和7AAD穩(wěn)定，標記胞內(nèi)分子時的固定和打孔操作不會影響EMA發(fā)射熒光信號的能力，在固定前標記EMA就可排除死細胞的影響。但是，EMA只有暴露在紫外條件下才能夠與DNA共價結(jié)合，而且EMA的熒光信號較弱。ViD是一種新型鑒定活細胞和死細胞的熒光染料，它與EMA一樣穩(wěn)定，固定和打孔的操作不會影響其發(fā)射熒光的能力，在分析胞內(nèi)分子時，固定前標記ViD可鑒別死細胞和活細胞，而且其標記過程簡單，熒光信號也較強，具有較好的應用前景。
