ABTS自由基清除能力測(cè)試試劑盒

（A005-96T 酶標(biāo)板法）

一、 測(cè)定原理

采用ABTS（2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt）評(píng)價(jià)樣品抗氧化能力初由Miller等（1993）提出，現(xiàn)采用的一般是后來(lái)Re等（1999）改進(jìn)后的方法。該方法利用ABTS可被過(guò)硫酸鉀、過(guò)氧化氫、二氧化錳等一系列化合物氧化，生成藍(lán)綠色的ABTS⁺陽(yáng)離子自由基，在734nm處有大吸收峰。在抗氧化劑的作用下， ABTS⁺還原成無(wú)色的ABTS。通過(guò)測(cè)定734nm處的吸光值，即可判定反應(yīng)物的抗氧化能力。

二、 試劑組成

試劑一：ABTS試劑300μL × 1支

試劑二：液體試劑300μL × 1支

試劑三：1mM Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液 1ml×1支（乙醇配制）

三、 儲(chǔ)存條件及有效期

試劑盒-20℃可保存6個(gè)月。

四、 試劑的配制

ABTS應(yīng)用液：將試劑二小心全部轉(zhuǎn)入試劑一管內(nèi)，旋好管蓋，搖勻，室溫放置12-16h，得到ABTS濃縮液。取10μLABTS濃縮液，采用稀釋液（稀釋液先采用純水20×稀釋）稀釋至734nm處吸光度為0.65-0.75，記下稀釋倍數(shù)（通常稀釋倍數(shù)為50-200倍，可先從80-100倍區(qū)間內(nèi)開(kāi)始嘗試。）將剩余濃縮液按稀釋倍數(shù)稀釋，得到ABTS應(yīng)用液，避光存放。

Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液：如您需要將樣品的ABTS自由基清除能力表示為Trolox當(dāng)量（TEAC），則需要同步測(cè)定Trolox的ABTS清除能力；如您僅需要將結(jié)果表示為ABTS自由基清除率，則您可以忽略此步驟（可以不需要用到試劑三）。

五、 操作步驟

充分混勻，室溫避光靜置30min³使之充分反應(yīng)。734nm處采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值。

¹如樣品顏色較淺可不做對(duì)照管（即認(rèn)為對(duì)照為0）；

²稀釋液即您配制樣品的溶劑，一般為水、乙醇、PBS等；

²建議反應(yīng)30min，數(shù)值更為準(zhǔn)確，但一般快速測(cè)定時(shí)，反應(yīng)10min即可（參考文獻(xiàn)：）。

六、計(jì)算公式

1. 簡(jiǎn)單計(jì)算清除率

2. 將清除率表示為Trolox當(dāng)量（Trolox Equivalent Antioxidant Capacity, TEAC）

先根據(jù)計(jì)算方法1求出不同濃度Trolox的ABTS自由基清除能力，并作出標(biāo)準(zhǔn)曲線（如下圖），再根據(jù)計(jì)算方法1求出樣品的ABTS自由基清除能力，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出TEAC。

注：1 如未做對(duì)照孔，可以將其視作為0；

      2 質(zhì)控孔求值時(shí)將其視作測(cè)定孔進(jìn)行計(jì)算即可。

七、注意事項(xiàng)

1. 如樣品中色素物質(zhì)不是分析對(duì)象，建議先進(jìn)行脫色處理，處理后樣品可不做對(duì)照孔；

2. 如不確定樣品的ABTS自由基清除能力，可先做不同濃度的稀釋液進(jìn)行摸索，并選擇適宜濃度進(jìn)行測(cè)定，高濃度下，濃度與清除率間并不線性相關(guān)。Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制建議選取100-1000μM的濃度進(jìn)行分析；

3. 混勻很重要，建議加樣時(shí)反復(fù)吹打，加樣結(jié)束后劇烈振搖酶標(biāo)板30秒以上（液體不能濺出來(lái)）。

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