鯊魚源性成分（Shark）熒光PCR核酸檢測試劑盒針對鯊魚源性成分基因高度保守區(qū)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針。在反應(yīng)體系中含鯊魚源性成分基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性、定量分析。

鯊魚源性成分(Shark)熒光PCR核酸檢測試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：?鯊魚源性成分(Shark)?核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

Name   ：Shark nucleic acid detection kit (fluorescence-PCR)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

動(dòng)物源性成分廣泛分布于食品、飼料、化妝品等，與人們的生活息息相關(guān)，其中食品和飼料所占的比例大。肉及肉制品摻假成為世界各國共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題，肉食品及其飼料的安全隱患直接關(guān)系到人類的安危。近幾十年來，以PCR技術(shù)為核心的動(dòng)物源性成分檢測獲得了廣泛應(yīng)用。

本試劑盒適用于動(dòng)物組織以及食品、飼料等樣本中鯊魚源性成分的檢測。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒對鯊魚源性成分基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性的引物和探針[1-3]，用熒光 PCR 技術(shù)對核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，從而達(dá)到快速檢測之目的。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

酶液 50μL×1 管

Chicken 反應(yīng)液 1.0mL×1 管

Chicken 陽性質(zhì)控品 50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μL ×1 管

注：

1）不同批號試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次。有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

取動(dòng)物組織及其制品、食品或飼料約 1g。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃。但不能超過6個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用0℃。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理：

取動(dòng)物組織及其制品、食品或飼料約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2DNA 提取

DNA 的提取推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的DNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間 收集熒光信號

1 1 cycle 95℃ 10min 否

2 40 cycles 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2判斷

a)檢測通道 Ct 值＜30.0，有 FAM 熒光信號檢出，并出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，判斷樣品為陽性。

b)當(dāng) 30.0≤Ct 值≤35.0 時(shí)，且有明顯的擴(kuò)增曲線時(shí)，則需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。再次擴(kuò)增后檢測體系的Ct 值仍≤35.0，且有明顯的擴(kuò)增曲線，則判定該樣品含有相應(yīng)的動(dòng)物源性成分。當(dāng)再次擴(kuò)增后，檢測體系 Ct 值＞35.0，或無明顯的擴(kuò)增曲線，則判定該樣品不含相應(yīng)的動(dòng)物源性成分。

6.檢測方法的局限性

1）樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2）樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3）陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4）病原體在流行過程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5）不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6）試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或   定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7）本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

a)空白對照：無FAM 熒光信號檢出或 Ct 值≥35.0，未出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

b)陰性對照：無FAM 熒光信號檢出或 Ct 值≥35.0，未出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

c)陽性對照：有 FAM 熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct 值＜30.0。

d)以上應(yīng)同時(shí)滿足，否則本次實(shí)驗(yàn)無效。

【注意事項(xiàng)】

1）所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；檢驗(yàn)過程中，參照《GB/T 27403 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品分子生物學(xué)檢測》的規(guī)定進(jìn)行。

2）試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，混勻并短暫離心；

3）反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4）反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5）使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；

6）樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7）實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

8）試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全   通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1]商務(wù)部. SB/T 10923-2012 肉及肉制品中動(dòng)物源性成分的測定實(shí)時(shí)熒光 PCR 法[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2012.

[2]王琰. 兔源性食品的PCR-mtDNA 鑒別[J]. 山東師范大學(xué), 2013.

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