霍亂弧菌O1（VC O1）熒光PCR核酸檢測試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術(shù)，設(shè)計一對霍亂弧菌O1特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光PCR技術(shù)對霍亂弧菌的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。在反應(yīng)體系中含基因組模板的情況下，反應(yīng)得以進行并釋放 熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性、定量分析。

霍亂弧菌O1(VC O1)熒光PCR核酸檢測試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：霍亂弧菌O1(VC O1)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)  

Name  ：Vibrio cholerae O1 (VC O1) nucleic acid detection kit (fluorescence-PCR method)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

霍亂弧菌O1(VC O1)是腸桿菌科中一大類重要的致病菌，感染畜禽后可引起一系列的疾病，成為畜禽肉胴體、畜禽產(chǎn)品污染的重要來源，并可以通過各種途徑傳染給人，引起人的食源性疾病[1]。為有效地預(yù)防和控制疾病發(fā)生，建立快速、敏感而又特異的檢測方法，PCR技術(shù)已成為檢測食品、臨床樣品和環(huán)境樣品中霍亂弧菌O1的重要手段[2,3]。

本試劑盒適用于檢測水樣糞便，疑似污染的水、食物等樣本中的霍亂弧菌O1，用于霍亂弧菌O1感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術(shù)，設(shè)計一對霍亂弧菌O1特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光PCR技術(shù)對霍亂弧菌O1的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

注：

1）不同批號試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過5次，有效期12個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。

【標(biāo)本采集】

水樣便取0.5~1mL；疑似污染的食物取1g

【保存和運輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用2~8℃冰袋運輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

水樣便13000rpm離心2min，去盡上清；疑似污染的食物用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；疑似污染的水直接取100μL

1.2DNA提取

1)對上述處理好的標(biāo)本加入50μL核酸提取液，100℃恒溫處理10min，13,000 rpm離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；

2)DNA的提取也可以采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

 

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到PCR反應(yīng)管中，21uL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光，選擇None即可。

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑：檢測通道Ct值>35.0，且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復(fù)試驗，重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn)Ct值≤35.0和典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結(jié)果無Ct值且無明顯的擴增曲線。

7.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線或無Ct值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤32；

以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

【參考文獻】

[1] 曾曉芳. 畜產(chǎn)品中霍亂弧菌O1?污染的檢測與控制[J]. 四川畜牧獸醫(yī), 2003, 30(4):28-29.

[2] Marijia T, Gorazd A, An improved 16S rRNA based PCR method for the specific detection of Salmonella enteria [J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 80: 67-75.

[3] Judy S W, Karen L J, Suresh D P, et al. Specific detection of Salmonella spp. By multiplex polymerase chain reaction [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(5): 1473-1479.

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