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偏光顯微鏡在中藥顯微鑒定中的應(yīng)用
中藥顯微鑒定是利用顯微鏡觀察植(動(dòng))物藥材內(nèi)部的細(xì)胞、組織構(gòu)造及細(xì)胞內(nèi)含物，明確其顯微特征，從而達(dá)到鑒別目的的一種鑒定方法，是中藥四大傳統(tǒng)鑒定方法之一，具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，并適用于破碎、粉末中藥的特點(diǎn)。1977年版《中國藥典》規(guī)定了藥材顯微鑒定，之后顯微鑒定被廣泛應(yīng)用于藥材和中成藥的鑒定，2010年版《中國藥典》收載的顯微鑒別更是達(dá)到2140項(xiàng)。然而隨著顯微鑒定被廣泛列入中藥材、中成藥的鑒別項(xiàng)下，顯微鑒定又需要操作者具備豐富的理論知識(shí)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，使得顯微鑒定成為檢驗(yàn)人員的負(fù)擔(dān)。
近年來，偏光顯微鏡利用其觀察特定目標(biāo)顯微組織快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)而得到關(guān)注，被越來越多地應(yīng)用到中藥顯微鑒定中，可明顯提高顯微鑒別的效率和準(zhǔn)確率。本研究選取了50余種具有代表性的中藥材和對(duì)照藥材粉末進(jìn)行了系統(tǒng)研究，在顯微鏡正常光和偏光狀態(tài)下對(duì)比觀察不同性質(zhì)的植物細(xì)胞壁及細(xì)胞內(nèi)含物、部分動(dòng)物藥和礦物藥的顯微組織特征，采用數(shù)碼成像系統(tǒng)拍攝，以期為偏光顯微鏡在中藥顯微鑒定中的應(yīng)用提供依據(jù)。
觀察方法
1.1不同性質(zhì)植物細(xì)胞壁偏光現(xiàn)象的觀察
傳統(tǒng)顯微鑒定的研究中，判斷植物細(xì)胞壁性質(zhì)是利用顯微化學(xué)反應(yīng)將目標(biāo)組織染色進(jìn)行。由于染色操作復(fù)雜，一次染色只能觀察一種類型細(xì)胞壁，染色法基本只用于教學(xué)和科研，不適用于日常檢驗(yàn)。目前日常檢驗(yàn)的方法是將藥材粉末制成水合氯醛透化片，在顯微鏡正常光下尋找目標(biāo)組織，再利用數(shù)碼成像系統(tǒng)拍攝。新的偏光顯微技術(shù)方法也是將藥材粉末制成水合氯醛透化片，不同之處是在顯微鏡偏光下觀察，再利用數(shù)碼成像系統(tǒng)拍攝。水合氯醛透化片制片方法：取挖耳勺1勺藥材粉末置于載玻片一端，滴加2～3滴水合氯醛試液，將載玻片載藥材粉末一端置于酒精燈內(nèi)焰處受熱至微沸，立刻移至室溫處，待沸騰現(xiàn)象消失繼續(xù)受熱，反復(fù)微沸3次，即透化*，冷卻，蓋蓋玻片，制片完成。植物細(xì)胞壁的性質(zhì)包括木質(zhì)化、木栓化、角質(zhì)化細(xì)胞壁及纖維素細(xì)胞壁。以下藥材粉末制成水合氯醛透化片后分別在正常光和偏光下對(duì)不同性質(zhì)植物細(xì)胞壁進(jìn)行對(duì)比觀察。
1.1.1木質(zhì)化細(xì)胞壁分別選擇黃芪、甘草、浙貝母、干姜、川木通、川牛膝、大血藤、天花粉、化橘紅、白薇、桔梗的導(dǎo)管，黃芪、甘草、干姜、川木通、川牛膝、白薇、蒼術(shù)、枇杷葉的纖維，黃芪、訶子、天冬、大血藤、川木通、馬錢子、天花粉、白薇、蒼術(shù)的石細(xì)胞，唐古特大黃、掌葉大黃的非木質(zhì)化導(dǎo)管，訶子、車前草、薄荷的腺毛，訶子、馬錢子、車前草、芫花、穿心蓮、化橘紅、桑葉的非腺毛作為觀察對(duì)象，將各藥材粉末制成水合氯醛透化片后分別在顯微鏡的正常光和偏光下觀察。
1.1.2木栓化或角質(zhì)化細(xì)胞壁選擇甘草、唐古特大黃、掌葉大黃、麻黃、川木通、川牛膝、大血藤、蒼術(shù)、桔梗木栓細(xì)胞或角質(zhì)層為觀察對(duì)象，按上述方法進(jìn)行觀察。
1.1.3纖維素細(xì)胞壁選擇麻黃、干姜、川牛膝、天麻、化橘紅、蒼術(shù)、枇杷葉、桔梗的纖維素薄壁細(xì)胞壁為觀察對(duì)象，按上述方法進(jìn)行觀察。
1.2植物細(xì)胞內(nèi)含物偏光現(xiàn)象的觀察
1.2.1淀粉粒觀察淀粉粒的制片方法與其他組織不同，是將藥材粉末制成水裝片進(jìn)行觀察。水裝片制作方法：取挖耳勺1勺藥材粉末置于載玻片一端，滴加2—3滴蒸餾水，蓋蓋玻片，制片完成。選擇浙貝母、川貝母、黃芪、唐古特大黃、掌葉大黃、干姜、天花粉、白薇、粉萆薜淀粉粒為觀察對(duì)象，將各藥材粉末制成水裝片后分別在顯微鏡的正常光和偏光下觀察。
1.2.2草酸鈣結(jié)晶選擇萑草、紅花、唐古特大黃、掌葉大黃、白薇、枇杷葉、顛茄草、桑葉草酸鈣簇晶，山藥、天冬、天麻、蒼術(shù)、粉萆薜、商陸草酸鈣針晶，甘草、麻黃、川牛膝、大血藤、化橘紅、白薇、枇杷葉草酸鈣方晶，牛膝、麻黃、山茱萸、川牛膝、顛茄草草酸鈣砂晶為觀察對(duì)象，將各藥材粉末制成水合氯醛透化片后進(jìn)行觀察。
1.2.3鐘乳體選擇穿心蓮、桑葉鐘乳體為觀察對(duì)象，將各藥材粉末制成水合氯醛透化片后進(jìn)行觀察。
1.2.4分泌組織選擇訶子、干姜、益智的油細(xì)胞和西洋參的樹脂道作為觀察對(duì)象，將各藥材粉末制成水合氯醛透化片后進(jìn)行觀察。
1.2.5菊糖結(jié)晶選擇桔梗、木香、蒼術(shù)、白術(shù)菊糖結(jié)晶為觀察對(duì)象，取各藥材粉末分別加70%乙醇浸泡24h，取浸泡后粉末制成水裝片后進(jìn)行觀察。
1.2.6黏液細(xì)胞選擇羅勒子、南葶藶子、胖大海、石斛、鐵皮石斛黏液細(xì)胞為觀察對(duì)象，將各藥材粉末制成水合氯醛透化片后進(jìn)行觀察。
1.2.7硅質(zhì)塊選擇石斛、鐵皮石斛、益智、砂仁硅質(zhì)塊為觀察對(duì)象，將各藥材粉末制成水合氯醛透化片后分別在顯微鏡的正常光和偏光下觀察。
1.3動(dòng)物藥偏光現(xiàn)象的觀察動(dòng)物毛發(fā)是由角蛋白組成，不同動(dòng)物的毛發(fā)角蛋白性質(zhì)和排列方式不同，因此在偏光下皮膚干涉色、髓腔指數(shù)和髓腔內(nèi)部構(gòu)造不同，顯示不同色彩和亮度，利用此性質(zhì)可對(duì)涉及毛發(fā)的動(dòng)物類中藥進(jìn)行鑒別。動(dòng)物骨、齒的磨片在偏光下有強(qiáng)烈的顏色和條紋對(duì)比，可利用偏光顯微鏡對(duì)動(dòng)物骨、齒進(jìn)行鑒別。
選擇正品一等海珠和全蝎剛毛為觀察對(duì)象，將各藥材粉末制成水合氯醛透化片后分別在顯微鏡的正常光和偏光下觀察。
1.4礦物藥偏光現(xiàn)象的觀察自然界的絕大部分礦物是由結(jié)晶質(zhì)組成，有明顯偏光現(xiàn)象，不同晶形的礦物在偏光下有不同形狀和色彩，因此可利用偏光顯微鏡對(duì)礦物藥進(jìn)行鑒別。選擇金礞石、朱砂、雄黃為觀察對(duì)象，將各藥材粉末制成水合氯醛透化片后分別在顯微鏡的正常光和偏光下觀察。
結(jié)果與討論
偏光顯微鏡用于檢測(cè)具有雙折性的物質(zhì)，它與正常光顯微鏡不同之處在于其光源前有偏振片(起偏振器)，使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中裝有另一偏振片(檢偏振器，一個(gè)偏振方向與起偏振器垂直的起偏振器);偏光顯微鏡的載物臺(tái)可以旋轉(zhuǎn)，當(dāng)載物臺(tái)上放人單折射的物質(zhì)時(shí)，無論如何旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)，由于兩個(gè)偏振光是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質(zhì)時(shí)，由于光線通過這類物質(zhì)時(shí)發(fā)生偏轉(zhuǎn)，因此旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)便能檢測(cè)到這種物體;顯微觀察時(shí)有偏光現(xiàn)象的顯微特征在暗視野下猶如黑夜里的星星，可以被快速準(zhǔn)確觀察到，因此可以提高顯微鑒別的效率和準(zhǔn)確率。本研究系統(tǒng)對(duì)比觀察研究了50余種植物藥不同性質(zhì)的細(xì)胞壁及細(xì)胞內(nèi)含物、動(dòng)物藥和礦物藥在正常光和偏光顯微鏡下的偏光現(xiàn)象，結(jié)果見表1和圖1。結(jié)果提示，木質(zhì)化細(xì)胞壁如木質(zhì)化的導(dǎo)管、纖維、石細(xì)胞具有強(qiáng)烈偏光現(xiàn)象，偏光鏡下具有特殊的彩色光澤，亮度與木化程度成正比;木栓化或角質(zhì)化細(xì)胞壁及纖維素細(xì)胞壁，在暗視野中無偏光現(xiàn)象，但在起偏振器和檢偏振器非正交狀態(tài)下有微弱偏光現(xiàn)象。細(xì)小淀粉粒在普通顯微鏡下與細(xì)小的油滴或糊粉粒等不易區(qū)別，特別是在大處方中成藥顯微鑒定時(shí)即使用碘試液染色后觀察也易受其他有色顯微組織碎片的干擾，而在偏光顯微鏡下淀粉粒清晰可見，臍點(diǎn)處呈十字交叉形，染色后偏光現(xiàn)象依然存在，但加熱糊化后偏光現(xiàn)象消失，檢查淀粉粒時(shí)可利用該性質(zhì)在暗視野下排除其他不具有偏光現(xiàn)象易混物質(zhì)的干擾，在大處方中成藥的顯微鑒定時(shí)，利用淀粉粒偏光現(xiàn)象不需染色即可快速發(fā)現(xiàn)細(xì)小的或散在植物組織中的少量淀粉粒。草酸鈣結(jié)晶在偏光下均具有明顯的偏光現(xiàn)象。碳酸鈣結(jié)晶因晶體排列不同出現(xiàn)不同的偏光現(xiàn)象，晶型排列整齊的碳酸鈣結(jié)晶無偏光現(xiàn)象或僅有微弱偏光現(xiàn)象，晶型排列沒有次序的碳酸鈣結(jié)晶則會(huì)呈現(xiàn)出不同鮮艷色彩，如圖1中穿心蓮1鐘乳體有明顯偏光現(xiàn)象，而穿心蓮2鐘乳體則偏光現(xiàn)象不明顯，只有微弱的偏光現(xiàn)象。分泌組織(脂肪油、揮發(fā)油、樹脂)、菊糖結(jié)晶、黏液細(xì)胞、硅質(zhì)塊無偏光現(xiàn)象或僅有弱偏光現(xiàn)象。動(dòng)物毛發(fā)、齒骨具有明顯的偏光現(xiàn)象。礦物藥因其大多為結(jié)晶礦物，具有明顯偏光現(xiàn)象，利用偏光顯微鏡對(duì)硅化合物類、鈣化合物類、鐵、砷化合物類、鈉鹽類、汞化合物類等34種常用礦物藥進(jìn)行了顯微鑒定。本研究中朱砂極細(xì)粉在正常光下顯鮮紅色或暗紅色，在中成藥制劑中極易與其中的成分混淆，但偏光下呈鮮紅色并帶光澤，易于檢出。雄黃粉末在正常光顯微鏡下呈橙黃色，無光澤，在中成藥制劑中易與樹脂道或其他黃色物質(zhì)混淆，偏光下斷面顯彩色光澤，易于檢出。
隨著生活水平的提高，中藥不僅在治病方面發(fā)揮了*的功效，而且在藥膳食療中得到了廣泛的應(yīng)用。但中藥成分復(fù)雜、來源廣泛，如何鑒定真?zhèn)沃陵P(guān)重要。偏光顯微鏡在中藥材和中成藥檢測(cè)中可快速找到有偏光的顯微組織，特別是將偏光顯微技術(shù)引入大處方中成藥的顯微鑒定中能快速排除無偏光現(xiàn)象干擾物，準(zhǔn)確找到有偏光現(xiàn)象的目標(biāo)物。今后，如能擴(kuò)大偏光顯微鏡在中藥材、中成藥顯微鑒別中應(yīng)用的普及率，將給檢驗(yàn)工作帶來極大的便利。