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致瀉性大腸埃希氏菌五重 PCR 試劑盒
閱讀：193 發(fā)布時間：2020-12-25產(chǎn)品名稱：致瀉性大腸埃希氏菌五重 PCR 試劑盒產(chǎn)品規(guī)格：50T/盒
產(chǎn)品貨號：KLP08-A0231
產(chǎn)品簡介：
大腸埃希氏菌是一類能引起人體以腹瀉癥狀為主的病原菌，常見的致瀉大腸埃希氏菌主要包括腸道集聚 性 大 腸 埃 希 氏 菌（ enteroaggregative Escherichia coli, EAEC ）、 腸 道 致 病 性 大 腸 埃 希 氏 菌（enteropathogenic Escherichia coli， EPEC）、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC) (包括腸道出血性大腸埃希氏菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）)、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（enteroinvasive Escherichia coli, EIEC）。該菌廣泛存在于自然界，當(dāng)其污染食品或水源后，可引起細(xì)菌性食物中毒或水源性腹瀉病爆發(fā)流行，所以致瀉大腸埃希氏菌的檢測對社會衛(wèi)生健康具有極da的意義。
為了滿足致瀉大腸埃希氏菌檢測及研究的需要，本公司根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) GB4789. 6 合成了致瀉大腸埃希氏菌特征性基因特異性引物，并優(yōu)化形成本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行檢測具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、操作簡單等特點及優(yōu)點。
包裝規(guī)格及成分：
編號 | 成分 | 規(guī)格 |
試劑一 | 致瀉大腸埃希氏菌五重 PCR 反應(yīng)液 | 1 mL×1 管 |
試劑二 | 陽性對照 | 200 µL×1 管 |
試劑三 | 陰性對照 | 200 µL×1 管 |
使用說明書 | 1 份 | |
運輸及保存：低溫運輸，-20℃保存。操作步驟：
一、樣本制備（參考 GB4789. 6）
固態(tài)或半固態(tài)樣品：固體或半固態(tài)樣品,以無菌操作稱取檢樣 25 g，加入裝有 225 mL 營養(yǎng)肉湯的均質(zhì)杯中，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以 8000 r/min~10000 r/min 均質(zhì) 1 min~2 min，或加入裝有 225 mL 營養(yǎng)肉湯的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì) 1 min~2
min 。
液態(tài)樣品：以無菌操作量取檢樣 25 mL，加入裝有 225 mL 營養(yǎng)肉湯的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)，振蕩混勻。
二、增菌
將 1 制備的樣品勻液于 36℃±1℃ 培養(yǎng) 6 h，取 10 μL ,接種于 30 mL 腸道菌增菌肉湯管內(nèi)，于 42℃±1℃培養(yǎng) 18 h 。
三、分離
將增菌液劃線接種 MAC 和 EMB 瓊脂平板，于 36 ℃±1 ℃ 培養(yǎng) 18 h~24 h ,觀察菌落特征。在 MAC 瓊脂平板上，分解乳糖的典型菌落為磚紅色至桃紅色，不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色；在 EMB 瓊脂平板上，分解乳糖的典型菌落為中心紫黑色帶或不帶金屬光澤，不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色，應(yīng)挑取乳糖發(fā)酵，以及乳糖不發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的菌落。
四、PCR 模板制備
- DNA 提取:使用 1 μL 接種環(huán)刮取營養(yǎng)瓊脂平板或斜面上培養(yǎng) 18 h~24 h 的菌落懸浮在 200 μL 0. 85%滅菌生理鹽水中，充分打散制成菌懸液，于 13000r / min 離心 3min，棄掉上清液。加入 1 mL 滅菌去離子水充分混勻菌體，于 100℃水浴或者金屬浴維持 10 min；冰浴冷卻后 13000 r / min 離心 3 min，收集上清液；按 1∶ 20 的比例用滅菌去離子水稀釋上清液，取 5 μL 作為 PCR 檢測的模板；可用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌 DNA，操作方法按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。
- DNA 保存:所有處理后的 DNA 模板直接用于 PCR 反應(yīng)或暫存于 4 ℃ 并當(dāng)天進(jìn)行PCR 反應(yīng)；否則，應(yīng)在-20 ℃ 以下保存?zhèn)溆?1 周。也可用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌 DNA，操作方法按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。
五、試劑準(zhǔn)備
- 擴增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合液配制區(qū)進(jìn)行）：從試劑盒中取出 PCR 反應(yīng)液，解凍混勻，瞬離后向每個 PCR 管中各分裝 20 μL PCR 反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
- 加樣（在樣本處理區(qū)進(jìn)行）：在 PCR 反應(yīng)管內(nèi)加入 5 μL 制備的核酸樣本陽性對照或陰性對照，蓋上蓋子，輕彈混勻并瞬時離心后，立即轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)進(jìn)行反應(yīng)。總反應(yīng)體系如下表。
試劑 | 添加量（25 μL） |
致瀉大腸埃希氏菌五重 PCR 反應(yīng)液 | 20 μL |
DNA 樣品/陽性對照/陰性對照 | 5 μL |
六、PCR 檢測（在檢測區(qū)進(jìn)行） 請按照下表設(shè)置反應(yīng)程序：
階段 | 溫度設(shè)計 | 循環(huán)數(shù) | ||
預(yù)變性 | 98℃ | 30 | sec | 1 × |
PCR 反 應(yīng) | 98℃ | 15 | sec |
30 × |
55℃ | 30 | sec | ||
68℃ | 10 | sec | ||
反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物進(jìn)行 1.8%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后分析其條帶情況。 | ||||
【結(jié)果判定方法】結(jié)果判定
1) 陰性對照：無目的基因條帶
2) 陽性對照：有目的基因 Stx1（244 bp）和 sth（171 bp）的明顯條帶。
致瀉大腸埃希氏菌類別 | 陽性基因名稱 | 片段長度（bp） |
腸道聚集性大腸埃希氏菌（EAEC） | astA | 102 |
腸道致病性大腸埃希氏菌（EPEC） | escV | 544 |
產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌/腸道出血性大腸埃希 氏菌 （STEC / EHEC） | Stx1, escV+ Stx1 | 244 / 544+244 |
產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（ETEC） | sth | 647 |
腸道侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC） | ipaH | 171 |
注意事項
1. 開始檢測前請仔細(xì)閱讀本說明書，按要求操作。
2. 組織樣品的樣本處理和核酸擴增應(yīng)注意生物安全
3. 試劑使用前，應(yīng)充分融化均勻后，瞬時離心；PCR 反應(yīng)管避免反復(fù)凍融。
4. 加樣時應(yīng)使樣品落入反應(yīng)液中，不應(yīng)有樣品黏附于管壁上，加樣后應(yīng)盡快壓緊管蓋。
5. 經(jīng)樣品前處理液處理過的樣本，不能用于樣本保存，僅用于即時檢測
6. 研磨組織樣本不宜過大，以防雜質(zhì)含量高而抑制后續(xù)的 PCR 反應(yīng)。
7. 樣品前處理液可置于 4℃保存。
8. 本產(chǎn)品只能用于科研實驗，不能用于臨床診斷。