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帶你認(rèn)識(shí)熒光團(tuán)和光學(xué)濾光片
熒光團(tuán)是一種熒光染料，可作為蛋白質(zhì)、組織和細(xì)胞標(biāo)記的熒光標(biāo)記物，以供熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。熒光團(tuán)的運(yùn)作方式是吸收特定波長(zhǎng)區(qū)域(又稱為激發(fā)能量范圍)的能量，然后在其他特定波長(zhǎng)區(qū)域(又稱為發(fā)射能量范圍)內(nèi)重新發(fā)射該能量。
圖1：常見熒光團(tuán)光譜曲線
一般來(lái)說(shuō)，熒光團(tuán)會(huì)被高頻率的照明(紫外、紫色或藍(lán)色光譜區(qū)域內(nèi)的波長(zhǎng))激發(fā)或吸收能量，然后會(huì)在頻率較低的照明(綠色、紅色或近紅外光譜區(qū)域內(nèi)的波長(zhǎng))中發(fā)射該能量。每種熒光團(tuán)都具備了能夠吸收能量的波長(zhǎng)，又稱為峰值激發(fā)波長(zhǎng)λ (nm)，以及能夠?qū)⑺盏降亩嗄芰恐匦掳l(fā)射的對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)，又稱為峰值發(fā)射波長(zhǎng)λ (nm)。選擇單獨(dú)光學(xué)濾光片以及大透射的波長(zhǎng)將能夠確保您獲得清晰度高的熒光圖像。
在熒光顯微鏡應(yīng)用中，典型的熒光顯微鏡設(shè)置包含了三個(gè)濾光片。有關(guān)典型熒光顯微鏡設(shè)置，請(qǐng)參閱圖2。
濾光片一：激發(fā)濾光片
激發(fā)濾光片是放置于熒光顯微鏡的照明路徑內(nèi)。其目的是用于過(guò)濾光源中的所有波長(zhǎng)，除了受檢測(cè)熒光團(tuán)的激發(fā)能量范圍。濾光片的小透射(%)是決定圖像亮度和清晰度的關(guān)鍵。對(duì)于任何激發(fā)濾光片，我們光學(xué)建議使用的小透射為40%，理想的透射為>85%。激發(fā)濾光片的帶寬應(yīng)*出現(xiàn)在熒光團(tuán)的激發(fā)能量范圍內(nèi)，而理想的濾光片的中心波長(zhǎng)(CWL)應(yīng)盡可能與受檢測(cè)的熒光團(tuán)的峰值激發(fā)波長(zhǎng)的長(zhǎng)度相近。
由于光密度(OD)是決定濾光片如何截止帶寬中波長(zhǎng)的衡量標(biāo)準(zhǔn)，因此激發(fā)濾光片的光密度是圖像背景暗度的關(guān)鍵。我們光學(xué)建議使用的小光密度為3.0，理想的光密度為6.0。具備理想的中心波長(zhǎng)、小透射(%)以及光密度的光學(xué)濾光片能夠提供清晰度高的圖像，而濾光片的深截止則能夠確保檢測(cè)到微弱的發(fā)射信號(hào)。
濾光片二：發(fā)射濾光片
圖2：典型熒光顯微鏡設(shè)置
發(fā)射濾光片是放置于熒光顯微鏡的成像路徑內(nèi)。其目的是用于過(guò)濾受檢測(cè)熒光團(tuán)的整個(gè)激發(fā)能量范圍，以及透射該熒光團(tuán)的發(fā)射能量范圍。對(duì)于發(fā)射濾光片，我們所建議的小透射、帶寬、光密度以及中心波長(zhǎng)均與激發(fā)濾光片相同。同樣的，具備理想的中心波長(zhǎng)、小透射(%)以及光密度的發(fā)射濾光片能夠提供清晰度高的圖像，而濾光片的深截止則能夠確保檢測(cè)到微弱的發(fā)射信號(hào)。
濾光片三：二向色性濾光片或分光器
二向色性濾光片或分光器是以45°角放置于激發(fā)濾光片與發(fā)射濾光片之間。其目的是用于將激發(fā)信號(hào)反射至受檢測(cè)的熒光團(tuán)，然后將發(fā)射信號(hào)透射至檢測(cè)設(shè)備。理想的二向色性濾光片或分光器應(yīng)能夠在大反射率和大透射率之間迅速過(guò)渡，激發(fā)濾光片帶寬的理想反射率為>95%，而發(fā)射濾光片帶寬的理想透射率為>90%。選擇濾光片時(shí)，應(yīng)該將熒光團(tuán)的相交波長(zhǎng)(λ)考慮在內(nèi)，以確保獲得低雜散光和高信噪比的熒光圖像。