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摘要在代謝組學研究中，可靠的代謝物注釋和標識對于提供生物學背景至關重要。也有助于了解哪些生物化學通路受到疾病狀態(tài)和候選藥物的影響，從而推進基礎生物學的研究。全面的譜庫有助于解決參與生物通路的代謝物鑒定的關鍵挑戰(zhàn)，從而助力生物學解析。本應用簡報介紹了全新的 Agilent Fiehn 精確質量代謝組學個人化合物數(shù)據(jù)庫與譜庫 (PCDL) 及其在使用血漿樣品進行的靶向和非靶向篩查工作流程中的表征和評估。為代謝組學應用提供精確質量 GC/MS 譜庫使研究人員能夠擴大復雜生物基質中代謝物鑒定的范圍、靈敏度和可靠性。

前言長期以來，GC/MS氣質聯(lián)用儀 一直被視為重要的靶向和非靶向代謝物分析工具。它憑借穩(wěn)定的性能、尖銳的峰形和可重現(xiàn)的電子電離(EI) 源譜圖在代謝物的鑒定中得到廣泛使用。最近，隨著高分辨率精確質量飛行時間 (TOF) 儀器的問世，研究人員擁有了更強大的資源，能夠更可靠地鑒定更多的生物相關分子。事實證明，GC/MS 質譜庫是輕松實現(xiàn)快速化合物鑒定的重要工具[1–4]。保留時間/指數(shù)和精確質量信息為確認或否決化合物鑒定結果提供了更多的證據(jù)，同時可有效降低假陽性率[5,6]。精確質量 GC/MS 譜庫特別適用于涉及復雜基質或目標化合物分子式較為復雜的應用，代謝組學應用就是其中之一。為了幫助提高代謝組學應用的可靠性和通量，創(chuàng)建了生物基質中常見化合物的精確質量保留時間鎖定 (RTL) EI 譜庫。該譜庫包含 900多個條目，涵蓋了廣泛的化合物類別。使用血漿樣品通過靶向和非靶向篩查工作流程對精確質量代謝組學 PCDL 庫進行了測試。此外，研究表明，精確質量代謝組學 PCDL 庫可用于鑒定各種組織樣品中的代謝物和共流出代謝物。

實驗部分樣品前處理對代謝物進行衍生化是提高極性代謝物的揮發(fā)性，使其更適用于 GC/MS 分析的常用方法。根據(jù)其他研究所述，本研究將代謝物標樣、血漿和組織提取物進行甲氧基化衍生，然后采用 MSTFA + 1% TMCS 進行硅烷化[7]。在進行衍生化前，向每個樣品中加入 D27 肉豆蔻酸作為內(nèi)標。使用乙腈:異丙醇:水(3:3:2) 從血漿和組織中提取代謝物。干燥物的提取和衍生化過程如前所述，然后用其來評估精確質量譜庫的篩查工作流程。

數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理使用精確質量高分辨質譜儀 Agilent 7250 GC/Q-TOF 系統(tǒng)采集已知色譜分離良好的單標或代謝物混合物的 EI 譜圖。包括標準品和提取物在內(nèi)的所有數(shù)據(jù)均在 70 eV 的 EI 模式下獲得。數(shù)據(jù)采集參數(shù)見表 1。精確質量代謝物 PCDL 中各化合物的保留指數(shù) (RIs) 都是基于脂肪酸甲酯和正構烷烴計算得到的。使用 Agilent MassHunter 10 版定性分析軟件將精確質量 EI 碎片轉換為理論 m/z 值。然后，使用 Agilent PCDL Manager 8.0 版軟件將譜圖導入精確質量代謝組學 PCDL。使用全新的譜庫管理軟件 Agilent ChemVista 1.0 對 PCDL 進行了進一步的修改，增加了關聯(lián)數(shù)據(jù)和化學結構信息。使用 Agilent MassHunter定量分析軟件（10.2 版和 11.1 版）（包括未知物分析軟件工具）對數(shù)據(jù)進行了處理。

結果與討論構建精確質量代謝組學 PCDL精確質量代謝物 PCDL 當中的化合物都是經(jīng)過挑選的，確保包含大多數(shù)參與主要代謝通路并適合進行 GC/MS 分析的代謝物。此外，為了擴大譜庫的適用范圍和效用性，還添加了250 多種生物基質中常見的次級代謝物和外源性物質。為了將所采集譜圖中的每個碎片離子 m/z 數(shù)值轉換為理論值，MassHunter 定性軟件會自動給譜圖中的碎片離子標注其對應的化學式。在將譜圖導出到 PCDL 之前，如有必要，可以對自動標注的化學式手動進行審查和更改（圖 1）。在 ChemVista譜庫管理軟件中添加化學結構、結構標識符（InChI String、InChIKey、SMILES）和各種數(shù)據(jù)庫標識符（CAS、PubChemID 等）等關聯(lián)數(shù)據(jù)。GC/Q-TOF 的精確質量代謝組學 PCDL 庫包含保留指數(shù)（基于正構烷烴和脂肪酸甲酯）。當前版本的譜庫包含 900 多張精確質量 EI 譜圖，對應 670 多種化合物。