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基因治療是指將正常的或者有治療作用的遺傳物質(zhì)引入到患者體內(nèi)使其表達(dá)從而達(dá)到治療目的。基因治療的關(guān)鍵是有效地將基因輸送到靶組織/細(xì)胞，這是通過(guò)基因遞送載體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。腺相關(guān)病毒(AAV)載體是目前基因治療中病毒載體之一，因其具有免疫原性低、不整合到宿主基因組、能夠在體內(nèi)提供長(zhǎng)期基因表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，在基因治療中顯示出巨大的潛力。
AAV是一種單鏈DNA(ssDNA)無(wú)包膜病毒，屬于細(xì)小病毒家族，直徑約25nm。目前有九種AAV血清型，每一種都有不同的嗜性，包括視網(wǎng)膜、肺、肌肉、肝臟和腦細(xì)胞。該病毒只由蛋白質(zhì)和DNA組成，其衣殼由衣殼蛋白VP1、VP2和VP3以 5：5：50的比例構(gòu)成。
在AAV藥物早期開(kāi)發(fā)階段，需要在多個(gè)工藝步驟中多次對(duì)AAV載體進(jìn)行定量從而不斷優(yōu)化工藝生產(chǎn)高滴度病毒載體。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法通常耗時(shí)多，效率低，自動(dòng)化程度低。Revvity公司現(xiàn)推出可以定量檢測(cè)多種AAV血清型的HTRF和AlphaLISA試劑盒，具有操作簡(jiǎn)單，樣本需求量少，線性范圍寬，可實(shí)現(xiàn)高通量等優(yōu)勢(shì)。產(chǎn)品列表如下：
部分驗(yàn)證數(shù)據(jù)
HTRF AAV2 capsid detection
檢測(cè)范圍：4.35E+09–6.00E+11VP/mL
AlphaLISA AAV2 capsid detection
檢測(cè)范圍：4.5E+06–1.0E+11VP/mL
空殼率計(jì)算
在AAV載體的制造過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生三種衣殼，分別是：完整衣殼（full capsid）、部分衣殼（partial capsid）和空衣殼（empty capsid）。其中部分衣殼和空衣殼屬于生產(chǎn)中的雜質(zhì)，因此需要在整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)空殼率。
在這里，我們介紹一種僅需要分別檢測(cè)衣殼和ssDNA的含量即可通過(guò)公式計(jì)算得到AAV樣品中完整衣殼（full capsid）百分比的新方法。
所需材料
1. 已知full capsid百分比的標(biāo)準(zhǔn)品（可購(gòu)買商品化標(biāo)準(zhǔn)品）
2. 待測(cè)樣品
公式推導(dǎo)
由于partial capsid在純化樣品中的百分比小于1%, 為簡(jiǎn)化后續(xù)計(jì)算，將它排除在分析之外。
N: number of AAV capsids in the sample
Ns: number of AAV capsids in the standard
f: full
e: empty
Rp: the ratio of the concentration (c) of proteins in the sample and standard
α: each capsid is composed of α μg of total proteins
RDNA: ratio for the concentration of ssDNA in the sample and standard
βs：the standard comes with a known percent of full capsids
通過(guò)以上公式換算便可得到樣本中full capsid的比例β
根據(jù)上述公式，我們可以通過(guò)運(yùn)用HTRF或AlphaLISA的AAV定量試劑盒分別檢測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品中衣殼數(shù)量，通過(guò)比值得到Rp。再通過(guò)LabChip、qPCR等其他ssDNA檢測(cè)手段分別檢測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品中ssDNA的濃度，通過(guò)比值得到RDNA。這樣通過(guò)引入標(biāo)準(zhǔn)品采用比值法，便可以顯著降低不同檢測(cè)方法之間的不匹配度，得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。
