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在癌癥免疫治療時(shí)代，諸如PD-1單抗等的熱門單靶點(diǎn)藥物競(jìng)爭(zhēng)已呈現(xiàn)狀態(tài)，產(chǎn)品同質(zhì)化嚴(yán)重，市場(chǎng)空間被嚴(yán)重?cái)D壓，且存在耐藥性風(fēng)險(xiǎn)，以上問(wèn)題刺激了對(duì)具有增強(qiáng)特異性和效力的雙特異性抗體的研究。雙特異性抗體（bsAb）是免疫療法中快速發(fā)展的領(lǐng)域，作為下一代癌癥治療策略備受關(guān)注。BsAb是重組分子，旨在同時(shí)靶向兩種不同的抗原或表位。這些抗體具有雙重鏈和輕鏈組成的傳統(tǒng) Y 形結(jié)構(gòu)，每個(gè)臂都有一個(gè)活性位點(diǎn)，可與不同的靶標(biāo)結(jié)合。根據(jù)生物學(xué)靶點(diǎn)和作用方式，bsAb分為四大類（如Figure 1）：

Figure 1. The types of bispecific therapeutics in immuno-oncology.

BsAb作用機(jī)制在各種癌癥的臨床前和臨床研究中取得了良好的療效，目前，已有八款癌癥免疫治療bsAbs獲得FDA/EMA 的批準(zhǔn)（如Table 1）。

Table 1: Approved therapeutic bsAbs for cancer indications.

相比于傳統(tǒng)單抗，bsAb在治療方面更具潛在優(yōu)勢(shì)，包括：（1）介導(dǎo)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷；（2）增強(qiáng)對(duì)免疫系統(tǒng)的激活作用；（3）雙靶點(diǎn)信號(hào)阻斷，防止耐藥；（4）具備更強(qiáng)特異性、靶向性和低脫靶毒性；（5）介導(dǎo)更強(qiáng)的內(nèi)吞作用。

BsAb 的功效、安全性和臨床成功受其特性的影響，包括理化特性（大小、穩(wěn)定性、結(jié)合親和力和效價(jià)）、藥代動(dòng)力學(xué) (PK)/藥效學(xué) (PD) 特性、可制造性和免疫原性等，bsAb的全面表征對(duì)于其設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)以及評(píng)估其功效和安全性至關(guān)重要，故需要從多方面并結(jié)合一系列技術(shù)來(lái)全面了解bsAb的特性以及驅(qū)動(dòng)免疫系統(tǒng)靶向癌細(xì)胞的能力。在這里，我們介紹幾種均相檢測(cè)技術(shù)來(lái)表征靶向免疫檢查點(diǎn)和腫瘤壞死因子 (TNF) 超家族的新型bsAb。

BsAb表征過(guò)程中的細(xì)胞因子研究的重要性

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（1）Evaluation of an anti-PD-1–GITR-L bispecific antibody

Chan等人研究了由抗PD-1抗體與抗GITR-L抗體融合組成的bsAb對(duì)免疫細(xì)胞活性的影響。作為研究的一部分，研究者進(jìn)行了PBMC共刺激檢測(cè)，以探究bsAb治療對(duì)細(xì)胞因子釋放的影響——將PBMC鋪板并在抗CD3存在的情況下用不同稀釋度的抗體進(jìn)行處理。孵育48h和96h后，使用AlphaLISA®試劑盒檢測(cè)收集的上清液中的IFN-γ和IL-2水平，并使用具有Alpha模塊的酶標(biāo)儀對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量。

結(jié)果顯示，與單一治療和1:1聯(lián)合治療相比，bsAb（抗 PD-1–GITR-L）治療可誘導(dǎo)細(xì)胞因子的劑量依賴性增加（如Figure 2）。該數(shù)據(jù)不僅提供了關(guān)于bsAb如何影響免疫細(xì)胞行為的見(jiàn)解，還強(qiáng)調(diào)了與單一療法和聯(lián)合療法的效果相比，抗PD-1-GITR-L雙特異性抗體如何具有不同的作用機(jī)制。

Figure 2: Human PBMC co-stimulation assay following the indicated treatments in the presence of anti-CD3. Cells and supernatants were harvested/collected for assessment of (A) IL-2, (B) IFN-γ, and (C) IFN-γ secretion in autologous CD4+ T cell MLR.

Figure 3: Principle of the AlphaLISA technology

AlphaLISA是一種基于微珠的均相檢測(cè)技術(shù)，AlphaLISA細(xì)胞因子測(cè)定使用兩種針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞因子的特異性抗體。一種是生物素化的，與鏈霉親和素包被的供體微珠結(jié)合，另一種則直接與受體微珠結(jié)合。在細(xì)胞因子存在的情況下，抗體與細(xì)胞因子結(jié)合，使供體和受體微珠靠近，當(dāng)供體微珠激發(fā)后產(chǎn)生單線態(tài)氧進(jìn)而激發(fā)受體微珠產(chǎn)生特異性信號(hào)，生成的AlphaLISA信號(hào)與樣品中存在的細(xì)胞因子的量成正比關(guān)系。

（2）Evaluation of an anti-PD-L1–VEGF bispecific antibody

2021年上海復(fù)旦大學(xué)張雪梅團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種新型雙特異性抗體HB0025，該抗體同時(shí)靶向PD-L1和VEGF。該bsAb是通過(guò)將VEGF受體1結(jié)構(gòu)域(VEGFR1D2)與抗PD-L1 mAb融合而形成的。作為研究的一部分，研究人員通過(guò)測(cè)量細(xì)胞因子分泌水平來(lái)評(píng)估HB0025阻斷PD-1和PD-L1之間相互作用的能力。將PBMC與樹(shù)突狀細(xì)胞在96孔板中共培養(yǎng)，并接受HB0025、atezolizumab（一種PD-L1靶向抗體）、bevacizumab（一種VEGF靶向抗體）、陰性對(duì)照 (900543) 的處理。經(jīng)過(guò)5天的孵育期后，使用HTRF技術(shù)檢測(cè)上清液中IL-2的濃度。

結(jié)果顯示，HB0025和atezolizumab均以劑量依賴性方式促進(jìn)IL-2分泌增加，VEGF靶向抗體bevacizumab不會(huì)影響IL-2的分泌（如Figure 4）。該數(shù)據(jù)證明了HB0025的抗腫瘤作用，并表明新型雙特異性抗體有效維持了其parent molecular的結(jié)合和阻斷能力。

Figure 4: The dose-effect fitting curve of antibodies on the recovery of human IL-2 secretion, taking 900543 as the negative control.

Figure 5: Principle of the HTRF assay

HTRF是一種基于熒光基團(tuán)的均相檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)將熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 技術(shù)與熒光時(shí)間分辨測(cè)量相結(jié)合（如Figure 5）。針對(duì)細(xì)胞因子檢測(cè)，其中一個(gè)抗體標(biāo)記了供體熒光基團(tuán)，另一個(gè)抗體標(biāo)記了受體熒光基團(tuán)，當(dāng)加入待分析物時(shí)，如果待分析物同時(shí)與兩個(gè)抗體都結(jié)合，則供體熒光基團(tuán)和受體熒光基團(tuán)的距離被拉進(jìn)，當(dāng)激發(fā)供體熒光基團(tuán)后，供體和受體之間產(chǎn)生FRET，進(jìn)而激發(fā)受體熒光基團(tuán)產(chǎn)生特異性信號(hào)，該信號(hào)與待分析物的濃度成正比關(guān)系。

BsAb表征過(guò)程中的殺傷作用的重要性

……

Rajendran等人研究靶向CD30和CD137的bsAb是否可以增強(qiáng)基于抗體治療霍奇金淋巴瘤（HRS）的特異性。該BsAb設(shè)計(jì)用于選擇性結(jié)合CD30/CD137雙陽(yáng)性HRS細(xì)胞。為了測(cè)試bsAb的殺傷效率，研究者使用DELFIA® EuTDA試劑盒進(jìn)行了ADCC測(cè)定。該項(xiàng)研究中，HRS細(xì)胞用DELFIA BATDA試劑標(biāo)記，并與雙特異性抗體和對(duì)照抗體一起接種到96孔板中，然后添加效應(yīng)細(xì)胞（NK細(xì)胞）并孵育3h。該測(cè)定的讀數(shù)基于使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量的熒光值，測(cè)量的信號(hào)值與裂解細(xì)胞的數(shù)量直接相關(guān)。

結(jié)果表明，與對(duì)照抗體相比，使用兩個(gè)bsAb clone進(jìn)行處理可使雙陽(yáng)性 (CD30+ CD137+) 細(xì)胞的殺傷率增加約4倍（如Figure 6）。此外，與自發(fā)裂解水平相比，這些clone對(duì)單陽(yáng)性細(xì)胞的殺傷效率相當(dāng)。這表明bsAb對(duì)雙陽(yáng)性細(xì)胞的選擇特異性，突出了bsAb觸發(fā)針對(duì)特定細(xì)胞群的ADCC潛力。

Figure 6: ADCC activity of bispecific antibodies.

HL cells were labeled with 1 μl/ml of BATDA reagent and treated with 5μg/ml of bispecific antibodies (137A-30A, 137A-30B) or human IgG(Isotype) for 40min at 4°C. Effector NK cells were added at E:T of 20:1 and incubated for more than 3 hours. Means ± SD of fold killing are represented (**p<0.01). Data are representative of three independent experiments.

Figure 7: DELFIA EuTDA Cytotoxicity Assay for ADCC Determination.

DELFIA Eu TDA檢測(cè)法是一種非放射性的細(xì)胞殺傷檢測(cè)方法，具有標(biāo)記特異性，高靈敏度，可操作性，安全性，穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)。如Figure 7，靶細(xì)胞與BATDA進(jìn)行孵育標(biāo)記，然后與抗體結(jié)合，并與免疫效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)?？贵w與靶細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，而效應(yīng)細(xì)胞與抗體的Fc區(qū)結(jié)合，與靶細(xì)胞形成復(fù)合物。復(fù)合物的形成會(huì)激活免疫效應(yīng)細(xì)胞，從而對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解，細(xì)胞裂解后TDA被釋放到上清液中。將上清液轉(zhuǎn)移至新的檢測(cè)板中，并添加Eu3+ solution以形成EuTDA螯合物，使用兼容時(shí)間分辨熒光（TRF）的酶標(biāo)儀進(jìn)行讀值（設(shè)置檢測(cè)信號(hào)在340nm處激發(fā)，在615nm處發(fā)射）。

小結(jié)

雙特異性抗體的成功在于其能夠克服當(dāng)前免疫療法的局限性，并提高療效和安全性。盡管目前獲批的bsAb產(chǎn)品不多，但隨著血友病領(lǐng)域雙特異性抗體 Emicizumab的成功上市，并在5年間成為年銷售額33億美元的全球重磅藥物，引發(fā)了一波雙特異性抗體研發(fā)熱潮。

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