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主要內容

1利用布魯克的單細胞光導系統(tǒng)實現(xiàn)上千個MSC單細胞的分離、培養(yǎng)、表型特征鑒定和回收。

2通過單細胞光導系統(tǒng)獲得克隆的關鍵質量屬性（CQA），包括生長、克隆形成潛能以及多系分化潛力。

研究背景

間充質干細胞（MSCs）自從50多年前被分離和鑒定，已顯示出巨大的臨床潛力。MSCs具有可以分化成多種細胞類型的能力，包括成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞。此外，它們免疫調節(jié)和抗炎特性使其適用于免疫治療和再生醫(yī)學，并成為組織工程領域的一個重要組成部分。

然而，觀察到的供體間、組織來源間以及細胞群體內的異質性對MSC作為再生療法的使用提出了挑戰(zhàn)，并可能影響其治療效果。當細胞暴露于相同的刺激或環(huán)境條件下時，隨機過程可能導致截然不同的反應。因此，傳統(tǒng)的測量MSC屬性的bulk方法可能會掩蓋細胞間的異質性。還需要確定是否可能純化出更均一、更有療效活性的細胞群體。

通過與新加坡A*STAR的IMCB團隊合作，我們利用布魯克細胞分析的單細胞光導系統(tǒng)，高精度操縱和分離單個細胞，并為單細胞生長提供適當?shù)沫h(huán)境，來應對體外MSC擴增和當前單細胞表型分析的局限性所帶來的挑戰(zhàn)。這項技術無縫集成了光電定位和微流控技術、先進的自動化、培養(yǎng)、高分辨率成像能力和機器視覺算法，為研究人員提供全新的研究單細胞的方式。

單細胞光導系統(tǒng)MSC工作流程

使用OptoSelect® 1500芯片在Lightning™單細胞光導系統(tǒng)上對永生化MSC細胞系UE7T-13細胞進行克隆，在芯片上培養(yǎng)六天，然后針對CD73、CD90和CD105表面標志物進行染色。在芯片上進行表型和生長特征鑒定后，將單個克隆從芯片中導出到96孔板中（圖1）。所有克隆在回收后都被繼續(xù)培養(yǎng)，一部分通過其他測定法和基本關鍵質量屬性（CQAs）進行評估，這些屬性由國際細胞治療學會（ISCT）確定用于定義MSCs [3]（具體實驗方法參考完整應用手冊）。

圖1. MSCs篩選工作流程示意圖。示意圖展示利用Beacon®進行MSCs的克隆、培養(yǎng)、分析和導出后進行下游分析的流程。

實驗結果

UE7T-13s是一種源自人骨髓的永生化MSC細胞系，被克隆并培養(yǎng)在三張OptoSelect® 1500芯片上。芯片用Adherent Cell Reagents Kit潤洗，經過胰蛋白酶處理后的MSCs以2.5百萬細胞/毫升的密度被導入芯片上。一旦進入芯片的通道，利用光電定位技術（OEP）以高精度將單個細胞移動到NanoPen小室中。平均每張芯片有1,079 ± 219個單個MSCs被成功分離并持續(xù)培養(yǎng)六天（圖2）。

圖2. 使用OptoSelect® 1500芯片分離和篩選838-1264個MSCs單細胞。

僅幾個小時的培養(yǎng)后，就可以觀察到MSCs已經粘附到芯片表面，并呈現(xiàn)出MSCs在2D組織培養(yǎng)處理表面上培養(yǎng)時的特征性擴展形態(tài)。經過六天的培養(yǎng)對細胞進行胰蛋白酶處理，并使用基于神經網(wǎng)絡模型的定制細胞檢測算法進行計數(shù)。平均芯片上克隆擴增的比例達到73.01 ± 6.88%（芯片上克隆擴增定義為用單個細胞加載的NanoPens中，繼續(xù)擴增成由四個或更多細胞組成的克隆的百分比）（圖3）。

圖3 細胞擴增和倍增時間。芯片上培養(yǎng)的6天內，67-81%的單細胞形成了四個細胞以上的克隆群體。

在分離和擴增克隆MSCs期間，至關重要的是它們保留自我更新和分化的能力。為了確認在布魯克單細胞光導系統(tǒng)上分離和培養(yǎng)的細胞保留了MSC表型，對六天后培養(yǎng)的克隆進行了CD73、CD90或CD105的染色。這三種表面標記已被ISCT認為是鑒定人類MSCs的基本標準[3]。大約96.3%的克隆為CD73陽性，96.6%為CD105陽性，95.2%為CD73陽性（圖4）。

圖4. 關鍵MSC表面標志物CD73、CD90和CD105在超過95%的單克隆中表達。

布魯克的單細胞光導系統(tǒng)能力之一是能夠在OptoSelect®芯片上培養(yǎng)和測定后回收單個克隆，可以根據(jù)克隆的擴增或者表面標志物回收特定克隆到96孔板的孔中。通過特殊的Bubble Dislodge方法，平均每個NanoPen中移出了7.4 ± 1.1個細胞，這約占每個小室中回收的總細胞數(shù)的59.3 ± 1.5%（圖5）。導出后，MSC克隆在37°C和5% CO2條件下培養(yǎng)，在含有100微升細胞培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)大約14天，然后對每個孔進行成像以確定持續(xù)的擴增。研究發(fā)現(xiàn)，從單個小室回收到8個或更多細胞的孔擴增略好，有66.7%的孔在培養(yǎng)2周后達到至少25%的匯合度，而接收到2到7個細胞的孔這一比例為56%（圖5）。

圖5. a) 在MSC克隆導出不同階段的NanoPen圖像；b) 平均7.4 ± 1.1個細胞可成功從每個小室內導出到96孔板上；c) 平均56.3 ± 1.5% 在小室內擴增的克隆被成功導出；d) 導出細胞數(shù)量對導出后克隆擴增能力的影響。

限制間充質干細胞（MSCs）在臨床應用中使用的一個主要挑戰(zhàn)是它們在體外長期擴增過程中的衰老，這可能導致在次級培養(yǎng)過程中分化潛力的喪失[4]。為評估MSC克隆在經過處理并從布魯克的單細胞光導系統(tǒng)導出后的克隆形成潛力和生長特性，進行了隨時間的生長特性分析以及克隆形成測定（CFU-F），并將結果與由異質MSCs群體組成的對照親本細胞系進行比較。生長特性分析顯示，三個擴增克隆和對照親本細胞系之間的累積細胞數(shù)量相似。每個克隆的平均CFU-F效率在35%到62%之間，而對照親本細胞系的平均效率約為45%，這表明在OptoSelect®芯片上經歷分離、培養(yǎng)和導出的MSC克隆保留了克隆形成能力（圖6）。

圖6. 克隆形成能力分析。在OptoSelect®芯片上導出并擴增后的三個克隆以及對照親本細胞系的a) 累積細胞數(shù)量和b)平均CFU-F效率；c) 代表性圖像顯示了對照親本細胞系和三個克隆的集落形成情況。

為了確保MSC表型得以保留，對三個擴增克隆進行了CD73、CD90和CD105表面標志物的染色。通過流式細胞分析，每個克隆中超過99%的細胞繼續(xù)表達所有三個標記物，與親本細胞系相似（表1）。

表1. ISCT表面標志物檢測結果

為了進一步評估MSC的效力，三個克隆被置于特定的間充質譜系誘導條件下，進行28天的成骨分化和成脂分化。通過分化為成骨細胞（成骨譜系）的細胞外鈣沉積的茜素紅S染色強度，以及分化為脂肪細胞（脂肪譜系）的脂滴的油紅O染色強度來驗證每個克隆的MSCs（n=3）分化為兩種譜系的能力（圖8）。這些結果表明，在布魯克單細胞光導系統(tǒng)上分離、培養(yǎng)和檢測的單個MSC克隆保留了強大的多譜系分化能力。

圖7. 多向分化能力。MSC克隆從單細胞光導系統(tǒng)導出后，分別進入成骨（茜素紅S）或成脂分化（油紅O）。圖像顯示了含有未誘導或誘導分化的細胞的孔板。

結論

在這篇應用說明中，我們展示了布魯克單細胞光導系統(tǒng)用于MSC的單細胞分離、培養(yǎng)、分析和導出，并獲取能夠幫助我們更好理解MSC異質性及其對基于MSC的治療產品的影響的關鍵表型和功能數(shù)據(jù)。從單細胞光導系統(tǒng)中導出的MSC克隆保留了MSC表型、克隆形成潛能和分化潛力。

參考文獻

1. A. J. Friedenstein, R. K. Chailakhjan, and K. S. Lalykina, Cell and Tissue Kinetics, vol. 3, no. 4, pp. 393–403, 1970.

2. Costa, Luis A., et al. Cellular and Molecular Life Sciences 78 (2021): 447-467.

3. Dominici, M. L. B. K., et al. Cytotherapy 8.4 (2006): 315-317.

4. Li, Yi, et al. International journal of molecular medicine 39.4 (2017): 775-782.