年轻漂亮的后玛,亚洲爆乳成人无码aaa片漫画,男同桌上课用手指进去了好爽,妺妺窝人体色777777

Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)與Opto® B Discovery抗體發(fā)現(xiàn)試劑盒讓研究人員能夠在一周內(nèi)從多個物種中發(fā)現(xiàn)和篩選出功能性候選抗體（圖1）。為生物制藥企業(yè)、科研實驗室和CRO的研究人員提供抗體藥物早期發(fā)現(xiàn)工具。Beacon®高通量的單B細(xì)胞抗體發(fā)現(xiàn)方式可能會在初期識別出數(shù)百至數(shù)千個抗原結(jié)合抗體。研究者可以利用OptoSelect芯片上的多輪篩選提高聚焦度。如果只是基于結(jié)合實驗進(jìn)行隨機選擇，往往需要重組表達(dá)眾多的抗體候選分子（hits），再經(jīng)歷重組表達(dá)和大量的驗證后才能縮減到少數(shù)進(jìn)入下游的先導(dǎo)抗體（leads）。

布魯克細(xì)胞分析的研發(fā)團隊基于現(xiàn)有的結(jié)合檢測，開發(fā)出Beacon親和力評分（Beacon Affinity Score）分析方法，在抗體篩選初期就能夠完成對上萬個抗體的親和力評估。通過對在納摩爾至皮摩爾范圍親和力的結(jié)合抗體進(jìn)行排序，讓使用者不再隨機選擇hits，而是根據(jù)親和力排序選擇潛力的候選序列進(jìn)行下游驗證。這將在不增加額外成本的情況下，幫助科學(xué)家增加評估維度，減少后續(xù)驗證壓力，提升功能抗體開發(fā)的成功率。此外，Beacon®平臺生成的大量數(shù)據(jù)為人工智能和機器學(xué)習(xí)的模型優(yōu)化添磚加瓦，或?qū)砜贵w工程和抗體開發(fā)領(lǐng)域革命。

圖1.利用Opto® B Discovery親和力分析開展抗體發(fā)現(xiàn)。在一周內(nèi)實現(xiàn)從多種物種B細(xì)胞無損克隆、功能優(yōu)先的單B細(xì)胞篩選（包括相對結(jié)合親和力）、以及回收單克隆抗體序列。

芯片上抗體功能篩選的實驗設(shè)計

可溶性抗原的相對親和力排名能夠與使用Cell Analysis Suite（CAS®）軟件3.2+版本的所有物種Opto® B Discovery工作流程兼容。它還能用于雜交瘤或其他抗體分泌細(xì)胞系（如瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞）的篩選。在芯片上完成單B細(xì)胞克隆后，使用多重?zé)晒庋訒r成像篩選抗體分泌細(xì)胞。檢測時需使用（i）包被有物種特異性IgG捕獲抗體的6-8µm檢測微珠；（ii）不同熒光基團標(biāo)記的抗原和IgG二抗（圖2a）。通過使用IgG捕獲微珠，我們分別量化分泌的抗體量以及與抗原的結(jié)合量，進(jìn)而評估結(jié)合強度（圖2b）。單B細(xì)胞分泌的抗體在NanoPen小室開口處及其周圍被微珠捕獲，分泌的抗體量與抗IgG二抗熒光強度等比例增強?？乖臒晒庖惨驗榭贵w分泌量以及抗體結(jié)合親和力的差異顯示出不同的熒光強度（圖2c）。

圖2. 基于微珠的多重檢測用于快速獲得Beacon親和力評分。A) 相對親和力排名的捕獲測定試劑將抗IgG包被的珠子、熒光素標(biāo)記的抗原和熒光素標(biāo)記的二抗結(jié)合。B）檢測微珠和試劑被導(dǎo)入到OptoSelect® 芯片通道中。C) 使用多重?zé)晒庋舆t成像來可視化在B細(xì)胞的NanoPen上方IgG分泌（綠色）和抗原特異性捕獲（品紅色）。

創(chuàng)新的抗體熒光定量方法用于親和力評分

Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)能夠自動識別數(shù)百至數(shù)千個結(jié)合抗體信號。完成初步分析后，CAS軟件利用機器學(xué)習(xí)算法識別分泌抗原特異性抗體的B細(xì)胞的NanoPen小室。除了識別陽性hits外，軟件現(xiàn)在還能夠自動計算IgG和抗原bloom的基于熒光的評分（圖3a）。該評分利用新開發(fā)的計算模型，根據(jù)熒光產(chǎn)生的時間、擴散的速度以及強度，得出IgG評分以量化捕獲的抗體量。相似的，抗原評分則將分泌抗體捕獲的抗原量進(jìn)行量化（圖 3b，黃色文本）。然后在Assay Analyzer™中通過IgG評分對抗原評分均一化（抗原評分 ÷ IgG評分），得出Beacon親和力評分，為抗體與抗原的結(jié)合強度提供相對測量（圖3b，白色框）。

圖3. Beacon親和力評分通過IgG分泌將抗原結(jié)合進(jìn)行均一化。A) IgG熒光強度與距離的擴散擬合曲線。從藍(lán)色到紅色的色梯表示時間進(jìn)展。插圖為IgG分泌的顯微圖。B) 同一NanoPen上IgG（綠色）和抗原（品紅色）評分（黃色）以及對應(yīng)的Beacon親和力評分（白色框）。

Beacon親和力評分的驗證

為了驗證親和力評分的效能，我們對六種分子量在18.6 kDa到125 kDa的可溶性抗原（TIM3、VEGFR2、IL6、IL10、IL17A和GMCSF）開展Opto® B Discovery抗體發(fā)現(xiàn)，抗原特異性抗體被隨機導(dǎo)出，這些抗體分的Beacon親和力評分隨機分布正在較廣范圍內(nèi)（圖4，黑色輪廓點）。

圖4.對VEGFR2、TIM3、IL6、IL10、IL17A和GMSCF的抗體篩選進(jìn)行Beacon親和力評分，并按每個實驗中的相對排名繪制。數(shù)據(jù)點從藍(lán)色（低親和力）到黃色（高親和力）著色。黑色輪廓點表示未排序?qū)С龅那?8個hits，顯示出隨機分布在總評分范圍內(nèi)。紫色框中的數(shù)據(jù)顯示了如果按Beacon親和力評分排序的前48個hits。百分比表示這些前48個hits與隨機選擇的hits的重疊比例。

我們針對每種抗原都選擇不同Beacon親和力評分的抗體進(jìn)行重組表達(dá)，并使用生物膜干涉技術(shù)（BLI，Octet）對選擇的抗體進(jìn)行親和力測定。實驗結(jié)果顯示Beacon親和力評分與實驗驗證的KD值具有相關(guān)性（圖5）。在不同的抗原中，我們發(fā)現(xiàn)親和力的范圍各不相同，有些范圍廣泛（例如，VEGFR2和TIM3，100 pM至100 nM），有些非常狹窄（例如，GMCSF，1 nM至15 nM）。我們通?？梢詤^(qū)分親和力小于1 nM（圖5，黃色數(shù)據(jù)點）的抗體組與親和力大于10 nM（圖5，藍(lán)色數(shù)據(jù)點）的抗體組。

圖5.Beacon親和力評分與實驗驗證的KD值相關(guān)。Beacon親和力評分（y軸）與驗證的KD值（x軸，Log10 刻度）相關(guān)聯(lián)。虛線表示線性回歸擬合，Spearman相關(guān)系數(shù)（rho）和p值揭示了不同的相關(guān)性。

基于Beacon親和力評分對hits進(jìn)行排序的能力對于具有廣泛抗體親和力范圍的抗原（如VEGFR2和TIM3）更為穩(wěn)??；然而，當(dāng)抗體的親和力范圍狹窄時（如針對GMCSF的抗體），排序的能力則相對有限。需要注意的是，Beacon親和力評分是單一抗原測定內(nèi)的相對測量，并非對親和力的絕對定量。盡管存在這些局限性，Beacon親和力評分在不增強額外成本的情況下提供提前篩選抗體相對結(jié)合強度的機會。

使用高級可視化方法探索抗體庫

研究人員可以利用Beacon親和力評分來深入了解抗體庫，如應(yīng)用UMAP等可視化手段，來分析獲得的抗體序列（圖6）[1]。通過將Beacon親和力評分與抗體氨基酸序列分析相結(jié)合，研究人員可以識別候選抗體的多樣性和高親和力抗體的聚類，探索編碼序列相似性與結(jié)合強度之間的關(guān)系，并選擇多樣化的候選抗體進(jìn)行進(jìn)一步表征。這種可視化和分析抗體庫的方法展示了Opto® B Discovery平臺生成的定量親和力數(shù)據(jù)如何與下游分析集成，以實現(xiàn)更有信息量和更高效率的抗體選擇。

圖6. VEGFR2特異性抗體序列的UMAP可視化。每個點代表一個單獨的抗體氨基酸序列，按Beacon親和力評分（藍(lán)色至黃色漸變）著色。星星表示BLI驗證親和力的抗體：黃色（KD <1 nM），灰色（KD 1-10 nM），藍(lán)色（KD >10 nM）。這種可視化使得探索序列多樣性、親和力聚類和選擇最佳抗體候選成為可能。

小結(jié)

布魯克細(xì)胞分析的Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)和Opto® B Discovery工作流程可以在單日內(nèi)篩選多達(dá)數(shù)千個抗原特異性hits。創(chuàng)新的Beacon親和力評分算法提供對相對親和力的定量數(shù)據(jù)和排序，讓抗原抗體結(jié)合檢測實驗附加上更大價值。對分子量在18.6 kDa至125 kDa范圍內(nèi)的幾種可溶性抗原的驗證數(shù)據(jù)顯示，其相對親和力排名與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法測量的解離常數(shù)具有很好的相關(guān)性。對抗體結(jié)合親和力的早期洞察將提升抗體篩選效率，增加抗體開發(fā)過程中下游成功的可能性。