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Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)與Opto® B Discovery抗體發(fā)現(xiàn)試劑盒讓研究人員能夠在一周內(nèi)從多個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)和篩選出功能性候選抗體（圖1）。為生物制藥企業(yè)、科研實(shí)驗(yàn)室和CRO的研究人員提供抗體藥物早期發(fā)現(xiàn)工具。Beacon®高通量的單B細(xì)胞抗體發(fā)現(xiàn)方式可能會(huì)在初期識(shí)別出數(shù)百至數(shù)千個(gè)抗原結(jié)合抗體。研究者可以利用OptoSelect芯片上的多輪篩選提高聚焦度。如果只是基于結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行隨機(jī)選擇，往往需要重組表達(dá)眾多的抗體候選分子（hits），再經(jīng)歷重組表達(dá)和大量的驗(yàn)證后才能縮減到少數(shù)進(jìn)入下游的先導(dǎo)抗體（leads）。

布魯克細(xì)胞分析的研發(fā)團(tuán)隊(duì)基于現(xiàn)有的結(jié)合檢測(cè)，開(kāi)發(fā)出Beacon親和力評(píng)分（Beacon Affinity Score）分析方法，在抗體篩選初期就能夠完成對(duì)上萬(wàn)個(gè)抗體的親和力評(píng)估。通過(guò)對(duì)在納摩爾至皮摩爾范圍親和力的結(jié)合抗體進(jìn)行排序，讓使用者不再隨機(jī)選擇hits，而是根據(jù)親和力排序選擇潛力的候選序列進(jìn)行下游驗(yàn)證。這將在不增加額外成本的情況下，幫助科學(xué)家增加評(píng)估維度，減少后續(xù)驗(yàn)證壓力，提升功能抗體開(kāi)發(fā)的成功率。此外，Beacon®平臺(tái)生成的大量數(shù)據(jù)為人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)的模型優(yōu)化添磚加瓦，或?qū)?lái)抗體工程和抗體開(kāi)發(fā)領(lǐng)域革命。

圖1.利用Opto® B Discovery親和力分析開(kāi)展抗體發(fā)現(xiàn)。在一周內(nèi)實(shí)現(xiàn)從多種物種B細(xì)胞無(wú)損克隆、功能優(yōu)先的單B細(xì)胞篩選（包括相對(duì)結(jié)合親和力）、以及回收單克隆抗體序列。

芯片上抗體功能篩選的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

可溶性抗原的相對(duì)親和力排名能夠與使用Cell Analysis Suite（CAS®）軟件3.2+版本的所有物種Opto® B Discovery工作流程兼容。它還能用于雜交瘤或其他抗體分泌細(xì)胞系（如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞）的篩選。在芯片上完成單B細(xì)胞克隆后，使用多重?zé)晒庋訒r(shí)成像篩選抗體分泌細(xì)胞。檢測(cè)時(shí)需使用（i）包被有物種特異性IgG捕獲抗體的6-8µm檢測(cè)微珠；（ii）不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗原和IgG二抗（圖2a）。通過(guò)使用IgG捕獲微珠，我們分別量化分泌的抗體量以及與抗原的結(jié)合量，進(jìn)而評(píng)估結(jié)合強(qiáng)度（圖2b）。單B細(xì)胞分泌的抗體在NanoPen小室開(kāi)口處及其周?chē)晃⒅椴东@，分泌的抗體量與抗IgG二抗熒光強(qiáng)度等比例增強(qiáng)?？乖臒晒庖惨?yàn)榭贵w分泌量以及抗體結(jié)合親和力的差異顯示出不同的熒光強(qiáng)度（圖2c）。

圖2. 基于微珠的多重檢測(cè)用于快速獲得Beacon親和力評(píng)分。A) 相對(duì)親和力排名的捕獲測(cè)定試劑將抗IgG包被的珠子、熒光素標(biāo)記的抗原和熒光素標(biāo)記的二抗結(jié)合。B）檢測(cè)微珠和試劑被導(dǎo)入到OptoSelect® 芯片通道中。C) 使用多重?zé)晒庋舆t成像來(lái)可視化在B細(xì)胞的NanoPen上方IgG分泌（綠色）和抗原特異性捕獲（品紅色）。

創(chuàng)新的抗體熒光定量方法用于親和力評(píng)分

Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)能夠自動(dòng)識(shí)別數(shù)百至數(shù)千個(gè)結(jié)合抗體信號(hào)。完成初步分析后，CAS軟件利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法識(shí)別分泌抗原特異性抗體的B細(xì)胞的NanoPen小室。除了識(shí)別陽(yáng)性hits外，軟件現(xiàn)在還能夠自動(dòng)計(jì)算IgG和抗原bloom的基于熒光的評(píng)分（圖3a）。該評(píng)分利用新開(kāi)發(fā)的計(jì)算模型，根據(jù)熒光產(chǎn)生的時(shí)間、擴(kuò)散的速度以及強(qiáng)度，得出IgG評(píng)分以量化捕獲的抗體量。相似的，抗原評(píng)分則將分泌抗體捕獲的抗原量進(jìn)行量化（圖 3b，黃色文本）。然后在Assay Analyzer™中通過(guò)IgG評(píng)分對(duì)抗原評(píng)分均一化（抗原評(píng)分 ÷ IgG評(píng)分），得出Beacon親和力評(píng)分，為抗體與抗原的結(jié)合強(qiáng)度提供相對(duì)測(cè)量（圖3b，白色框）。

圖3. Beacon親和力評(píng)分通過(guò)IgG分泌將抗原結(jié)合進(jìn)行均一化。A) IgG熒光強(qiáng)度與距離的擴(kuò)散擬合曲線。從藍(lán)色到紅色的色梯表示時(shí)間進(jìn)展。插圖為IgG分泌的顯微圖。B) 同一NanoPen上IgG（綠色）和抗原（品紅色）評(píng)分（黃色）以及對(duì)應(yīng)的Beacon親和力評(píng)分（白色框）。

Beacon親和力評(píng)分的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證親和力評(píng)分的效能，我們對(duì)六種分子量在18.6 kDa到125 kDa的可溶性抗原（TIM3、VEGFR2、IL6、IL10、IL17A和GMCSF）開(kāi)展Opto® B Discovery抗體發(fā)現(xiàn)，抗原特異性抗體被隨機(jī)導(dǎo)出，這些抗體分的Beacon親和力評(píng)分隨機(jī)分布正在較廣范圍內(nèi)（圖4，黑色輪廓點(diǎn)）。

圖4.對(duì)VEGFR2、TIM3、IL6、IL10、IL17A和GMSCF的抗體篩選進(jìn)行Beacon親和力評(píng)分，并按每個(gè)實(shí)驗(yàn)中的相對(duì)排名繪制。數(shù)據(jù)點(diǎn)從藍(lán)色（低親和力）到黃色（高親和力）著色。黑色輪廓點(diǎn)表示未排序?qū)С龅那?8個(gè)hits，顯示出隨機(jī)分布在總評(píng)分范圍內(nèi)。紫色框中的數(shù)據(jù)顯示了如果按Beacon親和力評(píng)分排序的前48個(gè)hits。百分比表示這些前48個(gè)hits與隨機(jī)選擇的hits的重疊比例。

我們針對(duì)每種抗原都選擇不同Beacon親和力評(píng)分的抗體進(jìn)行重組表達(dá)，并使用生物膜干涉技術(shù)（BLI，Octet）對(duì)選擇的抗體進(jìn)行親和力測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Beacon親和力評(píng)分與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的KD值具有相關(guān)性（圖5）。在不同的抗原中，我們發(fā)現(xiàn)親和力的范圍各不相同，有些范圍廣泛（例如，VEGFR2和TIM3，100 pM至100 nM），有些非常狹窄（例如，GMCSF，1 nM至15 nM）。我們通常可以區(qū)分親和力小于1 nM（圖5，黃色數(shù)據(jù)點(diǎn)）的抗體組與親和力大于10 nM（圖5，藍(lán)色數(shù)據(jù)點(diǎn)）的抗體組。

圖5.Beacon親和力評(píng)分與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的KD值相關(guān)。Beacon親和力評(píng)分（y軸）與驗(yàn)證的KD值（x軸，Log10 刻度）相關(guān)聯(lián)。虛線表示線性回歸擬合，Spearman相關(guān)系數(shù)（rho）和p值揭示了不同的相關(guān)性。

基于Beacon親和力評(píng)分對(duì)hits進(jìn)行排序的能力對(duì)于具有廣泛抗體親和力范圍的抗原（如VEGFR2和TIM3）更為穩(wěn)??；然而，當(dāng)抗體的親和力范圍狹窄時(shí)（如針對(duì)GMCSF的抗體），排序的能力則相對(duì)有限。需要注意的是，Beacon親和力評(píng)分是單一抗原測(cè)定內(nèi)的相對(duì)測(cè)量，并非對(duì)親和力的絕對(duì)定量。盡管存在這些局限性，Beacon親和力評(píng)分在不增強(qiáng)額外成本的情況下提供提前篩選抗體相對(duì)結(jié)合強(qiáng)度的機(jī)會(huì)。

使用高級(jí)可視化方法探索抗體庫(kù)

研究人員可以利用Beacon親和力評(píng)分來(lái)深入了解抗體庫(kù)，如應(yīng)用UMAP等可視化手段，來(lái)分析獲得的抗體序列（圖6）[1]。通過(guò)將Beacon親和力評(píng)分與抗體氨基酸序列分析相結(jié)合，研究人員可以識(shí)別候選抗體的多樣性和高親和力抗體的聚類(lèi)，探索編碼序列相似性與結(jié)合強(qiáng)度之間的關(guān)系，并選擇多樣化的候選抗體進(jìn)行進(jìn)一步表征。這種可視化和分析抗體庫(kù)的方法展示了Opto® B Discovery平臺(tái)生成的定量親和力數(shù)據(jù)如何與下游分析集成，以實(shí)現(xiàn)更有信息量和更高效率的抗體選擇。

圖6. VEGFR2特異性抗體序列的UMAP可視化。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)單獨(dú)的抗體氨基酸序列，按Beacon親和力評(píng)分（藍(lán)色至黃色漸變）著色。星星表示BLI驗(yàn)證親和力的抗體：黃色（KD <1 nM），灰色（KD 1-10 nM），藍(lán)色（KD >10 nM）。這種可視化使得探索序列多樣性、親和力聚類(lèi)和選擇最佳抗體候選成為可能。

小結(jié)

布魯克細(xì)胞分析的Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)和Opto® B Discovery工作流程可以在單日內(nèi)篩選多達(dá)數(shù)千個(gè)抗原特異性hits。創(chuàng)新的Beacon親和力評(píng)分算法提供對(duì)相對(duì)親和力的定量數(shù)據(jù)和排序，讓抗原抗體結(jié)合檢測(cè)實(shí)驗(yàn)附加上更大價(jià)值。對(duì)分子量在18.6 kDa至125 kDa范圍內(nèi)的幾種可溶性抗原的驗(yàn)證數(shù)據(jù)顯示，其相對(duì)親和力排名與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量的解離常數(shù)具有很好的相關(guān)性。對(duì)抗體結(jié)合親和力的早期洞察將提升抗體篩選效率，增加抗體開(kāi)發(fā)過(guò)程中下游成功的可能性。