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基因功能研究一直是科學研究的核心內容，科學家們往往先發(fā)現(xiàn)表型，再去研究機制，那么如何從表型出發(fā)發(fā)現(xiàn)相關的基因呢？高通量基因篩選應運而生。在基因篩選實驗中，RNA干擾（RNAi）仍然是有效的篩選方法。通過合成小干擾 RNA（siRNA）進行RNA干擾更是基因篩選研究的。
今天小編帶大家快速學習一篇Nature paper，看看siRNA基因沉默篩選如何開展，及最終如何發(fā)現(xiàn)病毒自噬新機制。
背景
細胞使用自噬來降價不需要的物質。自噬過程首先將不需要的物質隔離在自噬小體（autophagosome）中，然后自噬小體與溶酶體融合，將里面的物質降解為構成單元（building block），比如氨基酸，并將它們回收用于其他用途。
自噬物質包括舊的或有缺陷的細胞器和蛋白、細菌和病毒入侵者?？茖W家們已經基本確定了細胞啟動和調節(jié)自噬的途徑。然而，迄今為止還不清楚，是否有一條途徑專門針對病毒進行自噬。
研究過程
1.
為了尋找針對病毒的自噬途徑，首先開展了全基因組siRNA基因沉默篩選：
初篩基于自噬小體的點狀表型（GFP-LC3標記）：使用兩種病毒SIN或HSV-1ΔBBD感染 HeLa/GFP-LC3細胞后，細胞會產生GFP-LC3自噬小體點。作者分別用這兩個感染體系來進行篩選，使用了Dharmacon siGENOME siRNA全基因組文庫，通過成像檢測LC3點的數量，選擇那些沉默后導致病毒誘導自噬小體點減少的基因，且排除了那些有明顯細胞毒性（細胞生長異常）或者影響生理性自噬的基因，初篩共獲得了310個潛在陽性基因；
驗證性篩選（去卷積篩選）基本重復了這一過程，使用了Dharmacon Cherry-pick siGENOME library siRNA set of 4，僅有>=2條siRNA能重復出表型的基因被篩選出來，共篩選出來216個陽性基因，其中兩種病毒感染體系的交集有154個基因；
展開生物信息學分析，確定了分子功能相關的陽性基因集，再考慮到大多數病毒通過細胞內吞作用侵入細胞，最終選定SNX5（sorting nexin 5）作為進一步研究的對象。SNX5是一種細胞內吞體蛋白，包含兩段重要的結構域：一段可與磷酸肌醇（如 PtdIns(3)P）結合的PX結構域；一段感知、驅動膜結構彎曲的BAR結構域。
2.
在其他病毒中進一步驗證SNX5的效果：
細胞和小鼠的病毒感染實驗表明，siRNA沉默后SNX5后抑制了寨卡病毒（Zika virus）、西尼羅河病毒（WNV）、基孔肯雅病毒(CHIKV) 八種來自五個差異巨大的病毒科的人類病毒的感染后自噬；
3.
免疫共沉淀實驗分析SNX5的相互作用蛋白：
SNX5與PI3KC3-C1發(fā)生相互作用進而激活細胞自噬，兩者間相互作用無需PI3KC3-C1脂質激酶激活，提示SNX5作用于PtdIns(3)P上游；
4.
細胞定位實驗分析SNX5蛋白功能：
熒光標記病毒侵染細胞后發(fā)現(xiàn)SNX5選擇性募集到毒顆粒的內吞體表面，而BAR突變型SNX5不會出現(xiàn)募集。BAR結構域內帶正電基團可通過靜電作用介導帶BAR結構域的蛋白與雙層脂質結構相互作用，提示SNX5通過BAR結構域提高膜的曲率來活化自噬相關的PI3KC3-C1激酶復合體，從而激活自噬。
5.
驗證SNX5自噬通路是否是病毒誘導特異性的：
siRNA沉默囊泡轉運復合體基因VPS29并檢測葡萄糖轉運蛋白-1（GLUT-1）逆向轉運功能，VPS29敲減后囊泡轉運復合體功能發(fā)生障礙但病毒誘導自噬未受影響。另一方面，SNX5KO HeLa細胞轉鐵蛋白受體回收循環(huán)動力學和表皮生長因子降解效率均未受影響，提示SNX5敲除不影響早期及晚期細胞內吞活動。
討論
這些結果共同表明，細胞確實有一條的病毒自噬途徑，該途徑是由SNX5控制的。這一新發(fā)現(xiàn)細胞生物學、病毒學和自噬學中一個重要基礎知識的空白，并為基于自噬調控的廣譜抗病毒治療策略和藥物的研發(fā)提供了重要的基礎。
這篇研究全篇使用了Dharmacon的siRNA文庫，Dharmacon siRNA產品有如下特點：
SMARTselectionTM技術?高度特異性，確保沉默效率
我們使用SMARTselection™ 技術設計高質量siRNA，該技術涵蓋一整套完整而嚴密的設計算法，針對每個基因投放的4條siRNA至最終的產品中。
SMARTpoolTM技術?無需驗證，保證至少75％靶基因沉默效率
我們通過SMARTpoolTM技術更好的模擬內源RNAi通路，將針對同一靶基因的4條siRNA混合成為一管試劑，保證更高效的基因沉默效率。同時，由于每條siRNA的濃度相對降低而減少了脫靶效應（off-target），增強實驗數據的真實性。
雙鏈修飾技術，有效減少off-target并進一步提升沉默效率
siRNA是雙鏈結構，最主要的脫靶效應是由反義鏈中“seed region"活性引起的，此外，正義鏈也有可能引起脫靶。我們擁有的雙鏈修飾技術，對正義鏈和反義鏈同時進行修飾，能夠有效的減少脫靶效應90%以上，同時抑制miRNA-like作用，并能有效減少細胞的生長抑制，保證沉默效率的同時防止假陽性。
文獻好物推薦
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