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細(xì)胞株開發(fā)（Cell Line Development, CLD）是生物藥物開發(fā)過程中一個(gè)極為關(guān)鍵也十分復(fù)雜的過程。一個(gè)優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞株對(duì)于簡(jiǎn)化CMC階段的開發(fā)流程和顯著減少藥物研發(fā)成本具有關(guān)鍵影響。為了闡明這一關(guān)鍵工作流程，BioPhorum的細(xì)胞株開發(fā)小組成員團(tuán)隊(duì)制定開展了一項(xiàng)行業(yè)調(diào)研，調(diào)研結(jié)果以“When will we have a clone? An industry perspective on the typical CLD timeline“為題，發(fā)表在Biotechnology Progress期刊上。

這篇綜述為我們提供了深入的行業(yè)視角，探討了生物藥物細(xì)胞株開發(fā)（CLD）的復(fù)雜性，就CLD的挑戰(zhàn)和最佳實(shí)踐提供了寶貴的行業(yè)見解，旨在提高對(duì)生物治療藥物細(xì)胞株開發(fā)的理解和效率。盡管由于生物制劑開發(fā)平臺(tái)，不同公司的流程存在差異，但在關(guān)鍵工藝步驟中仍存在共性。

在調(diào)研中，布魯克的Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)被廣泛用于工業(yè)CLD實(shí)驗(yàn)室，在單細(xì)胞克隆、克隆性確認(rèn)和在過程早期識(shí)別高產(chǎn)細(xì)胞方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是該階段應(yīng)用最多的技術(shù)手段之一。

綜述主要內(nèi)容

調(diào)研覆蓋CLD以下三個(gè)主要階段針對(duì)性提出問題，共計(jì)341個(gè)問題：

1. 轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備：包括載體設(shè)計(jì)和構(gòu)建；

2. 轉(zhuǎn)染：涵蓋載體最初轉(zhuǎn)入細(xì)胞以及隨后的選擇和Pool的分析；

3. 單細(xì)胞克隆和先導(dǎo)克隆選擇：分離單細(xì)胞和確認(rèn)克隆來(lái)源的方法、后續(xù)擴(kuò)增和篩選過程以及識(shí)別和儲(chǔ)存最佳克隆的方法。

圖1. 針對(duì)CLD的三個(gè)不同階的調(diào)研方向描述

包括AbbVie、Bayer、GSK、Janssen、Merck&Co、Novo Nordisk、Pfizer、Takeda、BMS等27家大型制藥和CDMO公司參與調(diào)研（表1）。

表1. 參與調(diào)研的公司

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調(diào)研結(jié)果顯示出CLD過程的多樣性和共識(shí)，指出盡管不同公司采取了不同的方法，但大多數(shù)公司能夠在24至28周內(nèi)完成從基因到主克隆的整個(gè)過程。這一時(shí)間跨度受到多種因素的影響，包括克隆選擇所需的數(shù)據(jù)量、所承擔(dān)的風(fēng)險(xiǎn)程度以及不同平臺(tái)方法的效率。作者指出，CLD的關(guān)鍵在于平衡速度與質(zhì)量，確保在追求快速開發(fā)的同時(shí)，不犧牲細(xì)胞株的性能和穩(wěn)定性。此外，結(jié)論部分也體現(xiàn)了行業(yè)內(nèi)部合作的重要性，BioPhorum作為一個(gè)促進(jìn)知識(shí)共享和最佳實(shí)踐發(fā)展的平臺(tái)，對(duì)推動(dòng)行業(yè)發(fā)展起到了積極作用。

Beacon®平臺(tái)是單細(xì)胞克隆

和最佳克隆選擇階段的主要工具

單細(xì)胞克隆和最佳克隆篩選構(gòu)成了細(xì)胞株開發(fā)（Cell Line Development, CLD）流程中兩個(gè)密不可分的環(huán)節(jié)，它們通過精細(xì)的小規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和發(fā)酵工藝實(shí)現(xiàn)銜接。這一過程不僅耗時(shí)較長(zhǎng)，且需要巨大的工作量，它涉及將眾多的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)成為克隆群體，并通過一系列針對(duì)產(chǎn)量、增值速度和穩(wěn)定性、產(chǎn)物質(zhì)量等篩選流程，從數(shù)以千計(jì)的候選細(xì)胞中篩選出最佳細(xì)胞株。

調(diào)研結(jié)果顯示：所有參與調(diào)查的公司在開發(fā)抗體或復(fù)雜分子時(shí)都會(huì)進(jìn)行單細(xì)胞克隆。這也是符合監(jiān)管所要求的重組產(chǎn)品的細(xì)胞應(yīng)從單一細(xì)胞祖先克隆而來(lái)。大多數(shù)受訪者在克隆之前或期間對(duì)轉(zhuǎn)染池進(jìn)行特性化評(píng)估。在進(jìn)行單細(xì)胞克隆時(shí)有幾種技術(shù)平臺(tái)可供選擇，其中38%的受訪者表示在CLD實(shí)驗(yàn)室在單細(xì)胞克隆階段使用Beacon®平臺(tái)，是應(yīng)用最多的技術(shù)路徑（圖2）。

圖2. 用于單細(xì)胞克隆的主要設(shè)備

在單克隆篩選階段，大約一半的受訪者每個(gè)分子篩選多達(dá)2000個(gè)孔，其余的受訪者篩選4000到10,000個(gè)孔，作者認(rèn)為這些受訪者可能使用了Beacon®或者FACS等高通量的篩選方式。受訪者表示克隆效率存在較大差異，對(duì)于表達(dá)單克隆抗體的細(xì)胞株，克隆效率通常高于表達(dá)復(fù)雜分子的細(xì)胞株?？寺『蟮募?xì)胞需要在不同的培養(yǎng)器皿中擴(kuò)增，包括微孔板、試管旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器或搖瓶等。大多數(shù)受訪者在篩選克隆時(shí)主要考慮生長(zhǎng)速度、產(chǎn)量和單克隆性，而較少在單細(xì)胞克隆階段篩選產(chǎn)品質(zhì)量。

開發(fā)生產(chǎn)型細(xì)胞株的重要步驟之一是分離和擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞祖先，并能夠展示高概率或能確保單克隆性。96% 的受訪者在單細(xì)胞分離的第0天和之后成長(zhǎng)為細(xì)胞群體過程進(jìn)行成像。所有受訪者對(duì)于復(fù)雜分子的成像方式相同，這表明這一步驟作為克隆性評(píng)估的一部分非常重要。許多受訪者不僅僅使用Beacon®進(jìn)行單細(xì)胞克隆，還會(huì)用于成像以確?？寺⌒?，這讓Beacon®成為單克隆性確認(rèn)成像儀器中使用最多的技術(shù)路徑（圖3）。

圖3. 用于單克隆性確認(rèn)和細(xì)胞生長(zhǎng)記錄的影像記錄設(shè)備

為了提高效率，大多數(shù)受訪者采用了自動(dòng)化技術(shù)，包括單細(xì)胞、平板成像和擴(kuò)增過程中的克隆挑選。大約三分之一的受訪者在研究細(xì)胞庫(kù)（RCB）建立前進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估，而77%的受訪者在主克隆選擇前進(jìn)行。

從單細(xì)胞克隆到最終克隆選擇的預(yù)期時(shí)間中位數(shù)為17-20周，這個(gè)時(shí)間包括了發(fā)酵評(píng)估、產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)估和研究細(xì)胞庫(kù)的準(zhǔn)備。一些公司為了加速開發(fā)時(shí)間，可能會(huì)采取一些風(fēng)險(xiǎn)較高的做法，比如在RCB建立前不進(jìn)行穩(wěn)定性研究。

Beacon®系統(tǒng)在CLD領(lǐng)域的技術(shù)優(yōu)勢(shì)

Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)自上市以來(lái)其CLD工作流程被諸多國(guó)內(nèi)外大型制藥和CDMO企業(yè)采用。Beacon®能夠在短時(shí)間完成數(shù)千個(gè)單細(xì)胞的克隆、克隆性的確認(rèn)以及基于產(chǎn)量、生長(zhǎng)速度和產(chǎn)物質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)克隆篩選，加速藥物生產(chǎn)開發(fā)進(jìn)程，為后續(xù)生產(chǎn)找到細(xì)胞株。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

? 出色的單克隆性，獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)認(rèn)可

? 更高篩選通量，找到稀有優(yōu)質(zhì)克隆

? 全自動(dòng)實(shí)驗(yàn)流程，顯著縮短細(xì)胞株開發(fā)周期

? 可靠的定量檢測(cè)，與生物反應(yīng)器更好的相關(guān)性

? 兼顧細(xì)胞產(chǎn)率和產(chǎn)物質(zhì)量，篩選高品質(zhì)克隆

? 適用于各種類型生物制劑的細(xì)胞株開發(fā)