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癌癥的發(fā)展和進(jìn)化通常是由突變的積累驅(qū)動。這些突變可能由多種來源引起，如暴露于紫外線和氧化應(yīng)激等。然?同時發(fā)?的基因毒性事件導(dǎo)致的DNA堿基受損如何導(dǎo)致突變尚清楚。德國癌癥研究中心和愛丁堡大學(xué)的研究者近期在Nature Genetics（IF=30.1）上發(fā)表最新研究成果。他們提出一種新的策略，能夠在單細(xì)胞有絲分裂期間和單鏈分辨率下解析并量化單個細(xì)胞基因組進(jìn)化的不同機(jī)制。

為區(qū)分慢性（活性氧，ROS）和急性（紫外線，UV）誘導(dǎo)的突變，研究者使用布魯克的單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)將單個細(xì)胞在經(jīng)歷急性UV損傷后第一次有絲分裂得到的兩個姐妹分離開。借助單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)對單個細(xì)胞的精細(xì)操控和培養(yǎng)，研究者發(fā)現(xiàn)UV誘導(dǎo)的突變?yōu)榻忝眉?xì)胞特異性事件，揭示全基因組的鏡像突變。這項(xiàng)研究也讓當(dāng)前的轉(zhuǎn)錄相關(guān)ROS修復(fù)模型得到完善，證明了UV損傷的持續(xù)性，并對預(yù)測的損傷分離模型得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。研究者進(jìn)一步利用F1雜交小鼠在體內(nèi)證明可以將突變定相到肝腫瘤的單鏈DNA上。

該研究提出的體外和體內(nèi)研究策略可被廣泛應(yīng)用于分離和分析驅(qū)動癌癥基因組進(jìn)化的探索中。

圖1. 急性和慢性損傷來源的基因組突變定相模型。

a.在有絲分裂姐妹細(xì)胞之間創(chuàng)建鏡像突變模式的突變分離模型。b.模型系統(tǒng)，用于研究ROS突變的逐漸積累和急性突變壓力。實(shí)驗(yàn)包括標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)到紫外線照射，單細(xì)胞分選以及在第一次有絲分裂后將兩個姐妹細(xì)胞分離到單獨(dú)小室中，最后進(jìn)行細(xì)胞增殖。

建立系統(tǒng)：

利用單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)分離單次有絲分裂后的姐妹細(xì)胞

研究者利用單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)在一次有絲分裂后物理分離兩個哺乳動物姐妹細(xì)胞。這讓測試有關(guān)DNA損傷和修復(fù)的幾種假設(shè)成為可能。布魯克的單細(xì)胞光導(dǎo)平臺通過光電定位技術(shù)實(shí)現(xiàn)對單個細(xì)胞進(jìn)行無損操作，將細(xì)胞移動到芯片上的小室當(dāng)中（圖1b）。該平臺可以在一次有絲分裂事件中進(jìn)行延時成像追蹤細(xì)胞周期，在有絲分裂技術(shù)后物理分離姐妹細(xì)胞，并在芯片上對分離的細(xì)胞進(jìn)行增殖培養(yǎng)。隨后將擴(kuò)大的克隆群體導(dǎo)出到96孔板上并進(jìn)行全基因組測序（WGS），使研究者能夠確定這些姐妹細(xì)胞的突變情況。儀器配備的軟件能夠?qū)?xì)胞增殖進(jìn)行計(jì)數(shù)，在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞分裂的速度與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)中測量的速度相當(dāng)。

圖2. 利用單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)在哺乳細(xì)胞中區(qū)分慢性和急性突變。

為了控制倍性和細(xì)胞周期，研究者通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)將FastFUCCI載體整合到小鼠細(xì)胞系P388D1中。FUCCI（Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator）使用在細(xì)胞周期特定階段降解的熒光團(tuán)組合以標(biāo)記細(xì)胞所處的細(xì)胞周期（圖2b）。布魯克的單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)配備了與FUCCI熒光團(tuán)兼容的激光器和熒光通道，可觀察到PF1細(xì)胞的細(xì)胞周期從G2/M期（綠色）到G1期（紅色）狀態(tài)之間的切換。

姐妹細(xì)胞分析區(qū)分漸進(jìn)和急性誘變過程

研究者使用3秒的UVC照射細(xì)胞，導(dǎo)入進(jìn)OptoSelect芯片上后選擇了7個經(jīng)歷有絲分裂的細(xì)胞，并將來自7個獨(dú)立有絲分裂的14個子代姐妹細(xì)胞擴(kuò)展為足夠大以進(jìn)行全基因組測序的克隆集落。通過區(qū)分ROS和UV造成的不同突變特征以及突變頻率對不同的基因誘變過程進(jìn)行區(qū)分。研究者發(fā)現(xiàn)，獨(dú)立克隆之間共享的突變很少見，這表明每個克隆都是進(jìn)化軌跡的結(jié)果。UV突變對于每個姐妹細(xì)胞來說都是，而ROS突變可以細(xì)分為祖先突變和姐妹特細(xì)胞異性累積突變（圖3）。

圖3. 分析急性和慢性突變過程

有絲分裂姐妹細(xì)胞中的鏡像突變定相

在紫外線損傷后的第一次有絲分裂中，含有互補(bǔ)損傷的DNA鏈會分離成單獨(dú)的子細(xì)胞（圖4a）。如果發(fā)生姐妹染色單體交換（SCE）事件，受影響染色體上的等效位置顯示有絲分裂姐妹之間從混合不對稱到相反不對稱的轉(zhuǎn)變（圖4b）。分析結(jié)果表明，所有七對有絲分裂姐妹細(xì)胞在其基因組中都表現(xiàn)出鏡像突變的不對稱性（圖4d）。

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圖4. 有絲分裂姐妹細(xì)胞在整個基因組中具有鏡像突變分布。

此外，研究者還揭示紫外線損傷可以持續(xù)一個以上的細(xì)胞周期，從而驅(qū)動CC二核苷酸的多等位基因變異。慢性ROS損傷在階段性突變或轉(zhuǎn)錄相關(guān)修復(fù)中并不表現(xiàn)出鏈特異性。最后，研究者利用兩個SNP相差較大的親本小鼠進(jìn)行雜交和化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)，在單個染色單體水平上證明，幾乎所有突變都在F1小鼠的腫瘤中定相到一條DNA鏈上。

“這種巧妙的方法能夠追蹤單個受損細(xì)胞有絲分裂后的突變。通過這種方式，它有助于解決細(xì)胞如何接收和管理不同誘變劑留下的基因組疤痕。我們認(rèn)為，這項(xiàng)技術(shù)對于那些有興趣了解和比較突變過程的人來說將是無價的。"

Saia Danovi，《自然遺傳學(xué)》高級編輯

“這是一篇令人振奮的論文，我期待其見諸出版。作者介紹了他們開發(fā)的在單個細(xì)胞分裂過程中追蹤突變（由誘導(dǎo)或者慢性突變引入）的研究方法。這一創(chuàng)新方法依賴于在受控的細(xì)胞分裂次數(shù)后通過微流控技術(shù)將細(xì)胞進(jìn)行分離。這項(xiàng)研究成果具有很大影響力，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)，采用的方法和模型都創(chuàng)新性?！?/p>

John Maciejowski, MSKCC研究員

小 結(jié)

癌癥基因組進(jìn)化被認(rèn)為是達(dá)爾文過程，其中隨機(jī)突變和選擇壓力決定克隆擴(kuò)增。該研究方法分離有絲分裂后的姐妹細(xì)胞，并將突變壓力與正選擇解耦，從而實(shí)現(xiàn)兩個等位基因的正向和反向鏈的命運(yùn)跟蹤。

布魯克的單細(xì)胞光導(dǎo)平臺的關(guān)鍵貢獻(xiàn)在于它允許研究人員精確地操控單個細(xì)胞，在單次有絲分裂后物理分離姐妹細(xì)胞，并能在OptoSelect芯片上實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的培養(yǎng)。通過優(yōu)化的細(xì)胞培養(yǎng)條件，能夠讓細(xì)胞在芯片上以接近常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的速率增殖，同時保持基因組的二倍體狀態(tài)。布魯克的單細(xì)胞光導(dǎo)技術(shù)使用不僅解決了細(xì)胞周期狀態(tài)、細(xì)胞分裂次數(shù)和擴(kuò)增速率的準(zhǔn)確分析問題，而且使對細(xì)胞系進(jìn)行遺傳改造并施加多種誘變劑的測試成為可能。