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Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)不僅在抗體發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞株開(kāi)發(fā)領(lǐng)域已經(jīng)得到了國(guó)內(nèi)外工業(yè)和學(xué)術(shù)客戶的認(rèn)可，在針對(duì)T細(xì)胞的單細(xì)胞功能表征的應(yīng)用中也有越來(lái)越多的新研究成果發(fā)布。近期，布魯克細(xì)胞分析將陸續(xù)發(fā)布四份應(yīng)用指南，與大家分享和探討B(tài)eacon®的T細(xì)胞功能表征應(yīng)用在新型細(xì)胞療法的發(fā)現(xiàn)、驗(yàn)證和轉(zhuǎn)化研究階段的應(yīng)用。本期內(nèi)容將帶大家再次認(rèn)識(shí)Beacon®技術(shù)和提供的T細(xì)胞表型和功能的多維分析方法。

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過(guò)繼細(xì)胞療法（ACT）通過(guò)對(duì)?體或同種異體免疫細(xì)胞的工程化改造和移植，為正在進(jìn)行的抗癌?爭(zhēng)帶來(lái)了新的治療希望[1,2]。成功開(kāi)發(fā)過(guò)繼細(xì)胞療法需要在開(kāi)發(fā)過(guò)程的不同階段面臨多種挑戰(zhàn)（圖1）。在發(fā)現(xiàn)階段，對(duì)CAR/TCR和抗原進(jìn)行探索，以確定能夠提供針對(duì)癌細(xì)胞的有效靶向方式和有功效的候選藥物。之后的驗(yàn)證階段需要對(duì)CAR-T或TCR-T進(jìn)行嚴(yán)格評(píng)估以驗(yàn)證其性能。最后的轉(zhuǎn)化階段包括在臨床試驗(yàn)中測(cè)試有前途的候選藥物，以優(yōu)化治療并評(píng)估對(duì)患者的治療影響。

圖1.細(xì)胞療法開(kāi)發(fā)不同階段的目標(biāo)與挑戰(zhàn)

接下來(lái)我們將展示布魯克的Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)平臺(tái)如何利用光流控技術(shù)和OptoSelect芯?上的NanoPen納升級(jí)小室來(lái)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞功能表征，從表型、功能（細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒性）和序列等多個(gè)維度為細(xì)胞療法開(kāi)發(fā)提供創(chuàng)新工具。

Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)平臺(tái)和工作流程

Beacon®整合了精密調(diào)控的流路系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、顯微鏡、明場(chǎng)和熒光成像和AI圖像算法等功能，能夠用于操作和培養(yǎng)加載到OptoSelect芯?上的細(xì)胞。Beacon®平臺(tái)上的軟件算法可以根據(jù)芯?通道中的細(xì)胞或者微珠的大小、形態(tài)和熒光來(lái)進(jìn)行有效識(shí)別，并?動(dòng)將它們加載到每個(gè)芯?上的NanoPen小室中（圖2）。通過(guò)明場(chǎng)和熒光濾光?進(jìn)行延時(shí)成像使，研究?員能夠深入表征數(shù)千個(gè)單細(xì)胞的功能特征。Beacon®能夠根據(jù)篩選條件?動(dòng)導(dǎo)出具有特定功能的細(xì)胞，以用于開(kāi)展測(cè)序等下游分析。與其他依賴液滴或微孔的單細(xì)胞技術(shù)相比，Beacon®在細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)和表征上具備明顯優(yōu)勢(shì)：流路系統(tǒng)讓新鮮培養(yǎng)基持續(xù)注入到NanoPen上方的通道中，從?允許氧?、營(yíng)養(yǎng)物和細(xì)胞代謝廢物通過(guò)濃度梯度擴(kuò)散進(jìn)行有效交換，讓細(xì)胞維持在健康生理狀態(tài)下完成多種檢測(cè)和長(zhǎng)時(shí)間的追蹤（圖2）。

圖2. Beacon®系統(tǒng)和OptoSelect芯片上工作流程

動(dòng)態(tài)單細(xì)胞層面細(xì)胞毒性測(cè)定

針對(duì)腫瘤靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性是CD8+ T細(xì)胞的關(guān)鍵功能標(biāo)志。使用傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性檢測(cè)，例如鉻釋放測(cè)定或活/死細(xì)胞染?法等僅測(cè)量固定時(shí)間點(diǎn)的平均細(xì)胞殺傷率[6]。在單細(xì)胞?平上檢測(cè)細(xì)胞毒性可更細(xì)致地了解T細(xì)胞功能異質(zhì)性。這種在單細(xì)胞分辨率下的動(dòng)態(tài)追蹤將解釋細(xì)胞毒性的動(dòng)?學(xué)，能夠展?不同的細(xì)胞殺傷行為，例如快速殺傷的迅速響應(yīng)的和慢速殺傷的持續(xù)作用（圖3）。把這些數(shù)據(jù)與臨床特征聯(lián)系起來(lái)，將有助于我們加深對(duì)于過(guò)繼細(xì)胞療法復(fù)雜動(dòng)態(tài)特征的理解。

圖3. Beacon®上開(kāi)展單細(xì)胞層面細(xì)胞毒性分析

單細(xì)胞多重細(xì)胞因?分泌測(cè)定

單細(xì)胞層面細(xì)胞因?的功能性分泌已被證明是癌癥免疫治療療效的有效預(yù)測(cè)因?[7-9]。Beacon®能夠檢測(cè)三種客戶自定義的細(xì)胞因子。布魯克的IsoSpark/ IsoLight單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)分析平臺(tái)能夠提供30+種細(xì)胞因?分泌分析，可幫助識(shí)別驅(qū)動(dòng)細(xì)胞功能的關(guān)鍵細(xì)胞因?[10]。Beacon®平臺(tái)可將?組微珠加載到NanoPen室中以捕獲活細(xì)胞分泌出的細(xì)胞因?。然后在NanoPen室中導(dǎo)入單個(gè)T細(xì)胞和靶細(xì)胞或刺激物（如CD3/ CD28微珠）。經(jīng)過(guò)過(guò)夜的孵育后，使用?抗在芯?上處理微珠，并利用不同熒光通道的圖像捕獲以直接揭?單個(gè)T細(xì)胞的細(xì)胞因?分泌?平（圖4）。通過(guò)檢測(cè)T細(xì)胞在特定刺激下的單細(xì)胞分泌為研究者提供有探索價(jià)值的數(shù)據(jù)，并為了解功能性細(xì)胞因?分泌的機(jī)制創(chuàng)造了機(jī)會(huì)。

圖4. Beacon®上開(kāi)展T細(xì)胞三重細(xì)胞因子分泌測(cè)定

基于細(xì)胞表?標(biāo)志物的表型測(cè)定

Beacon®可利用熒光來(lái)檢測(cè)T細(xì)胞或靶細(xì)胞上是否表達(dá)特異表?標(biāo)志物，用于選擇性導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞導(dǎo)或?qū)?dǎo)入后的細(xì)胞分析其表面標(biāo)志物（圖5）。儀器能夠選擇性地將特定表型細(xì)胞加載到NanoPen室中。光流控技術(shù)直接在NanoPen室中設(shè)置細(xì)胞進(jìn)行功能測(cè)定，與FACS和其他細(xì)胞分選技術(shù)相比，需要更少的細(xì)胞。相比于FACS使細(xì)胞承受?流速和剪切應(yīng)?[11]，光流控技術(shù)依賴于將光照射在芯?上產(chǎn)生電場(chǎng)來(lái)輕輕推動(dòng)細(xì)胞，減少細(xì)胞受損。細(xì)胞導(dǎo)入后，還可以在細(xì)胞毒性和細(xì)胞因?測(cè)定過(guò)程中進(jìn)行表?標(biāo)志物染?，以提供有關(guān)表?表型的附加數(shù)據(jù)。例如，CD69或CD137染?可揭?具有細(xì)胞功能的細(xì)胞激活。相似地，可對(duì)細(xì)胞耗竭、持久性或共刺激等標(biāo)志物進(jìn)行染?。

圖5. Beacon®用于細(xì)胞表面標(biāo)志物和表型分析

整合多維分析結(jié)果，全?了解單細(xì)胞功能

Beacon®可以同時(shí)進(jìn)行三重細(xì)胞因?分泌、細(xì)胞毒性和表?標(biāo)志物測(cè)定。對(duì)同?單細(xì)胞進(jìn)行所有三種測(cè)定揭?了功能之間的復(fù)雜關(guān)系，這是使用傳統(tǒng)方法?法獲得的：通過(guò)分析細(xì)胞因?分泌和細(xì)胞毒性，揭?細(xì)胞殺傷是否與所分析的細(xì)胞因?相關(guān)。添加表?標(biāo)志物分析將激活或耗竭等變量與殺傷潛?和細(xì)胞因?分泌聯(lián)系起來(lái)。將Beacon®平臺(tái)生成數(shù)據(jù)用于創(chuàng)建多維可視化，區(qū)分具有不同功能特征的細(xì)胞群（圖6）。探索細(xì)胞群體的功能異質(zhì)性揭?對(duì)細(xì)胞行為的深入見(jiàn)解，這將為理解ACT性能的提供關(guān)鍵信息。

圖6. 根據(jù)細(xì)胞功能特征進(jìn)行分群

細(xì)胞導(dǎo)出和下游分析

Beacon®平臺(tái)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行后，研究者可以找到值得進(jìn)?步研究的細(xì)胞。利用光將NanoPen室中找到感興趣的細(xì)胞并將其導(dǎo)出到96孔板中。然后可以使用多種技術(shù)（例如TCR-seq或scRNA-seq）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析，以揭?細(xì)胞的TCR或轉(zhuǎn)錄組圖譜（圖7）。這些多組學(xué)見(jiàn)解直接揭?了單細(xì)胞?平上細(xì)胞功能的基因組和轉(zhuǎn)錄組驅(qū)動(dòng)因素[12]。成功利用Beacon®平臺(tái)的導(dǎo)出功能可以深入了解為什么某些細(xì)胞比其他細(xì)胞功能更強(qiáng)，從?識(shí)別關(guān)鍵機(jī)制，加速對(duì)癌癥免疫療法的理解和開(kāi)發(fā)。

圖7. Beacon®上目標(biāo)細(xì)胞回收

更多檢測(cè)

除了以上的分析方法，利用Beacon®的單細(xì)胞培養(yǎng)和延時(shí)拍照，研究者還能夠?qū)anoPen室中細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)追蹤，以分析細(xì)胞增殖能?。將多個(gè)靶細(xì)胞與T細(xì)胞?起導(dǎo)入NanoPen室中，則可以揭?T細(xì)胞是否具有連續(xù)殺死多個(gè)靶細(xì)胞的能力。計(jì)算靶細(xì)胞和T細(xì)胞之間的距離可用于生成有關(guān)運(yùn)動(dòng)、趨化性和突觸形成的數(shù)據(jù)。Beacon®平臺(tái)的靈