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Beacon®單細胞光導系統(tǒng)不僅在抗體發(fā)現(xiàn)和細胞株開發(fā)領(lǐng)域已經(jīng)得到了國內(nèi)外工業(yè)和學術(shù)客戶的認可，在針對T細胞的單細胞功能表征的應用中也有越來越多的新研究成果發(fā)布。近期，布魯克細胞分析將陸續(xù)發(fā)布四份應用指南，與大家分享和探討B(tài)eacon®的T細胞功能表征應用在新型細胞療法的發(fā)現(xiàn)、驗證和轉(zhuǎn)化研究階段的應用。本期內(nèi)容將帶大家再次認識Beacon®技術(shù)和提供的T細胞表型和功能的多維分析方法。

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過繼細胞療法（ACT）通過對?體或同種異體免疫細胞的工程化改造和移植，為正在進行的抗癌?爭帶來了新的治療希望[1,2]。成功開發(fā)過繼細胞療法需要在開發(fā)過程的不同階段面臨多種挑戰(zhàn)（圖1）。在發(fā)現(xiàn)階段，對CAR/TCR和抗原進行探索，以確定能夠提供針對癌細胞的有效靶向方式和有功效的候選藥物。之后的驗證階段需要對CAR-T或TCR-T進行嚴格評估以驗證其性能。最后的轉(zhuǎn)化階段包括在臨床試驗中測試有前途的候選藥物，以優(yōu)化治療并評估對患者的治療影響。

圖1.細胞療法開發(fā)不同階段的目標與挑戰(zhàn)

接下來我們將展示布魯克的Beacon®單細胞光導平臺如何利用光流控技術(shù)和OptoSelect芯?上的NanoPen納升級小室來實現(xiàn)單細胞功能表征，從表型、功能（細胞因子分泌和細胞毒性）和序列等多個維度為細胞療法開發(fā)提供創(chuàng)新工具。

Beacon®單細胞光導平臺和工作流程

Beacon®整合了精密調(diào)控的流路系統(tǒng)、細胞培養(yǎng)系統(tǒng)、顯微鏡、明場和熒光成像和AI圖像算法等功能，能夠用于操作和培養(yǎng)加載到OptoSelect芯?上的細胞。Beacon®平臺上的軟件算法可以根據(jù)芯?通道中的細胞或者微珠的大小、形態(tài)和熒光來進行有效識別，并?動將它們加載到每個芯?上的NanoPen小室中（圖2）。通過明場和熒光濾光?進行延時成像使，研究?員能夠深入表征數(shù)千個單細胞的功能特征。Beacon®能夠根據(jù)篩選條件?動導出具有特定功能的細胞，以用于開展測序等下游分析。與其他依賴液滴或微孔的單細胞技術(shù)相比，Beacon®在細胞的連續(xù)培養(yǎng)和表征上具備明顯優(yōu)勢：流路系統(tǒng)讓新鮮培養(yǎng)基持續(xù)注入到NanoPen上方的通道中，從?允許氧?、營養(yǎng)物和細胞代謝廢物通過濃度梯度擴散進行有效交換，讓細胞維持在健康生理狀態(tài)下完成多種檢測和長時間的追蹤（圖2）。

圖2. Beacon®系統(tǒng)和OptoSelect芯片上工作流程

動態(tài)單細胞層面細胞毒性測定

針對腫瘤靶細胞的細胞毒性是CD8+ T細胞的關(guān)鍵功能標志。使用傳統(tǒng)的細胞毒性檢測，例如鉻釋放測定或活/死細胞染?法等僅測量固定時間點的平均細胞殺傷率[6]。在單細胞?平上檢測細胞毒性可更細致地了解T細胞功能異質(zhì)性。這種在單細胞分辨率下的動態(tài)追蹤將解釋細胞毒性的動?學，能夠展?不同的細胞殺傷行為，例如快速殺傷的迅速響應的和慢速殺傷的持續(xù)作用（圖3）。把這些數(shù)據(jù)與臨床特征聯(lián)系起來，將有助于我們加深對于過繼細胞療法復雜動態(tài)特征的理解。

圖3. Beacon®上開展單細胞層面細胞毒性分析

單細胞多重細胞因?分泌測定

單細胞層面細胞因?的功能性分泌已被證明是癌癥免疫治療療效的有效預測因?[7-9]。Beacon®能夠檢測三種客戶自定義的細胞因子。布魯克的IsoSpark/ IsoLight單細胞功能蛋白質(zhì)組學分析平臺能夠提供30+種細胞因?分泌分析，可幫助識別驅(qū)動細胞功能的關(guān)鍵細胞因?[10]。Beacon®平臺可將?組微珠加載到NanoPen室中以捕獲活細胞分泌出的細胞因?。然后在NanoPen室中導入單個T細胞和靶細胞或刺激物（如CD3/ CD28微珠）。經(jīng)過過夜的孵育后，使用?抗在芯?上處理微珠，并利用不同熒光通道的圖像捕獲以直接揭?單個T細胞的細胞因?分泌?平（圖4）。通過檢測T細胞在特定刺激下的單細胞分泌為研究者提供有探索價值的數(shù)據(jù)，并為了解功能性細胞因?分泌的機制創(chuàng)造了機會。

圖4. Beacon®上開展T細胞三重細胞因子分泌測定

基于細胞表?標志物的表型測定

Beacon®可利用熒光來檢測T細胞或靶細胞上是否表達特異表?標志物，用于選擇性導入目標細胞導或?qū)牒蟮募毎治銎浔砻鏄酥疚铮▓D5）。儀器能夠選擇性地將特定表型細胞加載到NanoPen室中。光流控技術(shù)直接在NanoPen室中設置細胞進行功能測定，與FACS和其他細胞分選技術(shù)相比，需要更少的細胞。相比于FACS使細胞承受?流速和剪切應?[11]，光流控技術(shù)依賴于將光照射在芯?上產(chǎn)生電場來輕輕推動細胞，減少細胞受損。細胞導入后，還可以在細胞毒性和細胞因?測定過程中進行表?標志物染?，以提供有關(guān)表?表型的附加數(shù)據(jù)。例如，CD69或CD137染?可揭?具有細胞功能的細胞激活。相似地，可對細胞耗竭、持久性或共刺激等標志物進行染?。

圖5. Beacon®用于細胞表面標志物和表型分析

整合多維分析結(jié)果，全?了解單細胞功能

Beacon®可以同時進行三重細胞因?分泌、細胞毒性和表?標志物測定。對同?單細胞進行所有三種測定揭?了功能之間的復雜關(guān)系，這是使用傳統(tǒng)方法?法獲得的：通過分析細胞因?分泌和細胞毒性，揭?細胞殺傷是否與所分析的細胞因?相關(guān)。添加表?標志物分析將激活或耗竭等變量與殺傷潛?和細胞因?分泌聯(lián)系起來。將Beacon®平臺生成數(shù)據(jù)用于創(chuàng)建多維可視化，區(qū)分具有不同功能特征的細胞群（圖6）。探索細胞群體的功能異質(zhì)性揭?對細胞行為的深入見解，這將為理解ACT性能的提供關(guān)鍵信息。

圖6. 根據(jù)細胞功能特征進行分群

細胞導出和下游分析

Beacon®平臺對活細胞進行后，研究者可以找到值得進?步研究的細胞。利用光將NanoPen室中找到感興趣的細胞并將其導出到96孔板中。然后可以使用多種技術(shù)（例如TCR-seq或scRNA-seq）對細胞進行分析，以揭?細胞的TCR或轉(zhuǎn)錄組圖譜（圖7）。這些多組學見解直接揭?了單細胞?平上細胞功能的基因組和轉(zhuǎn)錄組驅(qū)動因素[12]。成功利用Beacon®平臺的導出功能可以深入了解為什么某些細胞比其他細胞功能更強，從?識別關(guān)鍵機制，加速對癌癥免疫療法的理解和開發(fā)。

圖7. Beacon®上目標細胞回收

更多檢測

除了以上的分析方法，利用Beacon®的單細胞培養(yǎng)和延時拍照，研究者還能夠?qū)anoPen室中細胞的數(shù)量進行計數(shù)追蹤，以分析細胞增殖能?。將多個靶細胞與T細胞?起導入NanoPen室中，則可以揭?T細胞是否具有連續(xù)殺死多個靶細胞的能力。計算靶細胞和T細胞之間的距離可用于生成有關(guān)運動、趨化性和突觸形成的數(shù)據(jù)。Beacon®平臺的靈活性為研究?員提供了?與倫比的工具來實時監(jiān)測和分析活的單細胞。