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Revvity小動(dòng)物活體光學(xué)成像技術(shù)已在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床前醫(yī)學(xué)研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域 得到廣泛應(yīng)用。在眾多應(yīng)用領(lǐng)域中，腫瘤免疫治療已經(jīng)成為活體光學(xué)成像技術(shù)的熱點(diǎn)之一。腫瘤免疫 治療被稱為繼手術(shù)、放療、化療后第四種療法；與傳統(tǒng)治療方式不同，免疫療法是激發(fā)或調(diào)動(dòng)機(jī)體的 免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞，是療法是當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域前景的研究方向之一。因?yàn)榻鼛啄暝谂R床實(shí)驗(yàn)上取得的巨大成功，腫瘤免疫療法被Science雜志評(píng) 為2013年科學(xué)突破，目前腫瘤免疫療法策略主要包括腫瘤疫苗、細(xì)胞因子治療、抗體治療 和過(guò)繼性細(xì)胞治療四類。小動(dòng)物活體光學(xué)成像技術(shù)可以在活體動(dòng)物水平無(wú)創(chuàng)地監(jiān)測(cè)：1、疫苗、抗體、 免疫細(xì)胞等在體內(nèi)的分布及病灶靶向；2 、評(píng)價(jià)免疫療法的治療效果；3 、評(píng)價(jià)治療手段對(duì)機(jī)體免疫系 統(tǒng)的影響。以下將圍繞上述四類免疫療法策略，詳細(xì)介紹活體光學(xué)成像技術(shù)在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。
一．腫瘤疫苗相關(guān)研究
腫瘤疫苗是通過(guò)激活患者自身免疫系統(tǒng)，利用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性細(xì)胞免 疫和體液免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長(zhǎng)、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)，以達(dá)到清除或控制腫瘤的
目的。腫瘤疫苗分為預(yù)防性疫苗和治療性疫苗，前者將與某些特定腫瘤發(fā)生有關(guān)的基因制備成疫苗， 接種于具有遺傳易感性的健康人群，預(yù)防腫瘤的發(fā)生，后者主要用于化療后的輔助治療。根據(jù)腫瘤疫 苗的來(lái)源，又可分為腫瘤細(xì)胞疫苗、基因疫苗、多肽疫苗、樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗、細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）表位肽疫苗等。應(yīng)用 Revvityr IVIS 小動(dòng)物活體成像技術(shù)可以無(wú)創(chuàng)地監(jiān)測(cè)腫瘤疫苗 的預(yù)防及治療效果、疫苗在動(dòng)物體內(nèi)的分布靶向及疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫效應(yīng)等。
1. 以細(xì)菌為載體的預(yù)防性腫瘤疫苗
人表皮生長(zhǎng)因子受體 2（HER2）的高表達(dá)、點(diǎn)突變及基因刪除與多種癌癥（乳腺癌，卵巢癌，胰 臟癌，胃癌和直腸癌）緊密聯(lián)系。單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Lm，Listeria monocytogenes）是一種兼 性胞內(nèi)寄生菌，可以用于疫苗載體。給予 Balb /c 小鼠進(jìn)行新型單核細(xì)胞增多性李斯特菌-人表皮生長(zhǎng)因 子受體 2 嵌合疫苗免疫注射，然后靜脈注射螢火蟲(chóng)熒光素標(biāo)記的小鼠乳腺癌細(xì)胞（4T1-luc），利用 Revvityr 的 IVIS 成像系統(tǒng)即可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)，進(jìn)而評(píng)價(jià)疫苗的預(yù)防效果。結(jié)果顯示經(jīng)嵌合疫 苗免疫的乳腺癌模型小鼠的生物發(fā)光強(qiáng)度明顯弱于單核細(xì)胞增多性李斯特菌免疫的對(duì)照組（下圖） 。 研究表明細(xì)菌受體嵌合疫苗能夠明顯推遲肺癌腫瘤的發(fā)生，轉(zhuǎn)移，并能有效提高小鼠存活率

Balb/c 小 鼠 免 疫 單 核 細(xì)胞增 多性 李 斯特 菌 （control Lm），或者單核細(xì)胞增多性李斯特菌- 人表皮生長(zhǎng)因子受體 2 嵌合疫苗（Lm-hHer2/neu chimera）。然后靜脈注射螢火蟲(chóng)熒光素標(biāo)記小鼠 乳腺癌細(xì)胞（4T1-luc）

Seavey et al.,Clin Cancer Res 2009;15(3):924-32.
.
2. 溶瘤病毒介導(dǎo)的治療性腫瘤疫苗

CG0070是在卡介苗（BCG）對(duì)膀胱癌安全性和劑量評(píng)價(jià)失敗后，Cell Genesys公司研制的腫瘤治療 性疫苗，該疫苗在2005年進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)，涉及35例非肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌（NMIBC）的治療。目前Cold Genesys已經(jīng)引進(jìn)該藥物，并在2014年3月開(kāi)始招募2/3期研究，并有望在2018年獲得最終數(shù)據(jù)。CG0070 治療腫瘤的作用是通過(guò)雙重機(jī)制來(lái)完成的，首先該疫苗是一種條件復(fù)制型溶細(xì)胞腺病毒，可以直接靶 向腫瘤細(xì)胞并在腫瘤細(xì)胞中增殖，干擾腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；其次該病毒表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 （GM-CSF），使體內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞加入戰(zhàn)斗。Cell Genesys公司在研究中利用Revvityr的IVIS 系統(tǒng)，評(píng)價(jià)了在小鼠原位膀胱癌的移行細(xì)胞癌（TCC）模型中CG0070的抗腫瘤活性。結(jié)果顯示PBS組 小鼠給藥42天時(shí)較初次給藥，腫瘤的生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度大幅增加（1只小鼠無(wú)明顯變化），在CG0070治 療組（1周1次，連續(xù)6周）9只小鼠中有4只在42天時(shí)已經(jīng)檢測(cè)不到腫瘤信號(hào)。而另一CG0070治療組（1 周2次，連續(xù)3周）中，8只動(dòng)物中5只在32天時(shí)未檢測(cè)到腫瘤信號(hào)，1只小鼠的腫瘤信號(hào)減少，其他腫瘤 大小穩(wěn)定未增長(zhǎng)，只有一只腫瘤信號(hào)增強(qiáng)。另外， 免疫組化結(jié)果顯示CG0070治療組中無(wú)腫瘤的小鼠在 膀胱組織未檢測(cè)出腫瘤細(xì)胞。

SW780-Luc 原位膀胱腫瘤模型評(píng)價(jià)CG0070效果。（ A – C）：建立模型后，小鼠膀胱灌注50 μl PBS或者CG0070 (3 ×1010病毒 顆粒/次) 共計(jì)6次，為了監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)，每周使用IVIS系統(tǒng)進(jìn)行生物發(fā)光成像；圖像如上圖所示。D ：CG0070在瘤內(nèi)復(fù)制 的腫瘤切片圖（n=4），給藥24小時(shí)后取小鼠膀胱（a,c:PBS;b,d:CG0070），對(duì)石蠟包埋的膀胱組織切片進(jìn)行染色，腫瘤檢 測(cè)使用人膀胱癌SW780細(xì)胞20AE1抗體(a和 b) ，病毒復(fù)制監(jiān)測(cè)進(jìn)行hexon蛋白染色(c 和d)。二者免疫組化都使用
3,3V-diaminobenzidine 染色，箭頭所指為抗體相互作用的區(qū)域。 Ramesh et al., Clin Cancer Res.2006;12(1): 305-13.
3. 多肽類腫瘤疫苗

多肽疫苗是按照病原體抗原基因中已知或預(yù)測(cè)某段抗原表位的氨基酸序列，通過(guò)體外合成技術(shù)制 備而得到的多肽片段。Gp100 是胚胎早期出現(xiàn)的分化抗原，在黑色素瘤中過(guò)度表達(dá)，屬于黑色素腫瘤 相關(guān)抗原。gp100 疫苗（福氏不佐劑 IFA 為乳化劑）III 期臨床研究表明，使用疫苗免疫病人的客 觀有效率高于高劑量 IL-2 治療組一倍，同時(shí)也增加病人無(wú)疾病進(jìn)展生存時(shí)間。然而在外周血增加的特 異性 CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)，并沒(méi)有有效的引起腫瘤的縮小，這一現(xiàn)象同樣是眾多疫苗臨床試驗(yàn)中遇到的問(wèn) 題。Yared Hailemichael 認(rèn)為，這主要是由疫苗佐劑 IFA 引起的，該佐劑以礦物油為基礎(chǔ)，廣泛應(yīng)用于 疫苗開(kāi)發(fā)，以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。為了驗(yàn)證這個(gè)論點(diǎn)，研究人員對(duì) T 細(xì)胞進(jìn)行了光學(xué)標(biāo)記，并使用 Revvityr 的 IVIS 成像系統(tǒng)對(duì) T 細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期追蹤。結(jié)果顯示，在接種了不含 IFA 疫苗的小鼠體內(nèi)，發(fā)光 T 細(xì)胞 大量存在于腫瘤中，而接種位點(diǎn)處很少；接種了含 IFA 疫苗的小鼠體內(nèi)，T 細(xì)胞在注射位點(diǎn)處聚集，

而腫瘤中很少。并且抗原/IFA 能夠持續(xù)在接種位點(diǎn)聚集，在接種30 天后仍能在該處刺激 T 細(xì)胞增殖。 最終使機(jī)體產(chǎn)生一系列誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白，使接種處的 T 細(xì)胞。

gp100/IFA免疫導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞啟動(dòng)和低反應(yīng)性。d.血液中pmel-1T細(xì)胞的平均數(shù)量（上）， 白化C57ABL/6小鼠接種黑色素瘤7 天，腫瘤大小可觸，經(jīng)疫苗免疫gp100/IFA(s.c) 或/和VSV.GP100（表達(dá)gp100的水泡炎病毒,iv），在IL-2治療3天后尾靜脈注射 1×106V-effLuc-pmel-1 T細(xì)胞，免疫4天后進(jìn)行生物發(fā)光成像，T：腫瘤、V：免疫位點(diǎn)、 S ：脾臟；e.B16黑色素瘤模型小鼠， 在IL-2治療3天后尾靜脈注射1×106V-effLuc-pmel-1 T細(xì)胞，gp100/IFA或者control/IFAs.c.免疫7天后成像，圓圈顯示腫瘤的位置； 結(jié)果顯示VSV.GP100免疫小鼠后pmel-1 T細(xì)胞在血液中迅速擴(kuò)增，并且在腫瘤中累積，而VSV.gp 100和gp100/IFA共免疫組，
在血液中也檢測(cè)出pmel-1T細(xì)胞，但是主要集中在注射位點(diǎn)，腫瘤中累積很少。

gp100/IFA免疫誘導(dǎo)長(zhǎng)期的抗原遞呈和T細(xì)胞隔離。（a）白化C57ABL/6小鼠接種黑色素瘤7天，IL-2治療3天尾靜脈注射
1×106V-effLuc-pmel-1 T細(xì)胞，在皮下接種疫苗gp100/IFA的0天，-30天或者control/IFA的0天時(shí)進(jìn)行成像及定量分析。之前結(jié)果 顯示，T細(xì)胞在注射位點(diǎn)的積累是抗原刺激產(chǎn)生的，此實(shí)驗(yàn)考查的是gp100/IFA引起這種效應(yīng)可以持續(xù)多長(zhǎng)的時(shí)間，結(jié)果顯示， 相較其他位點(diǎn)，Pmel-1T細(xì)胞積累在0和30天前接種的gp100/IFA

使用短期水佐劑疫苗 T 細(xì)胞則定位在腫瘤。（a）白化 C57ABL/6 小鼠接種黑色素瘤 7 天，IL-2 治療 3 天尾靜脈注射
1×106V-effLuc-pmel-1 T 細(xì)胞，在皮下接種疫苗 gp100/IFA 的 0 天，-30 天或者 control/IFA 的 0 天時(shí)進(jìn)行成像和定量分析。
結(jié)果顯示新型的鹽/肽/covax 疫苗比 IFA/肽/covax 疫苗更有優(yōu)勢(shì)，前者能使 T 細(xì)胞集中攻擊腫瘤細(xì)胞，而后者確使 T 細(xì)胞聚集 在集中的位點(diǎn)，殺死正常組織并誘導(dǎo)趨化因子的生成，最終導(dǎo)致 T 細(xì)胞的死亡。
Yared Hailemichael et al., Nature Medicine.2013; 9(4): 465-76.

4. 樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗

樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）是目前所知功能的專職抗原遞呈細(xì)胞。DC疫苗是將體外培養(yǎng)的負(fù)載腫瘤抗 原的DC導(dǎo)入體內(nèi)，這些DC通過(guò)抗原提呈功能及分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)腫瘤抗原特異性、Th1細(xì)胞增殖活化， 并進(jìn)一步促進(jìn)NK細(xì)胞及CTL活化，介導(dǎo)腫瘤殺傷。例如在2010年4月29日第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)的治療性 疫苗Dendreon的Provenge正是DC疫苗。Laura Alaniz利用Revvityr IVIS小動(dòng)物活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)了在 小鼠結(jié)腸癌模型中，通過(guò)低分子量透明質(zhì)酸（LMW HA）預(yù)處理的負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗，更傾向于 向淋巴結(jié)的遷移，從而增強(qiáng)誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

BALB/c小鼠皮下接種5×105 個(gè)CT26細(xì)胞，建 立小鼠皮下瘤模型。在接種7天后，用脂溶性 熒光染料Dir標(biāo)記DC/TL/LMW HA或DC/TL 細(xì)胞，并將1×106 標(biāo)記的細(xì)胞，皮下注射到 腫瘤結(jié)節(jié)和局部淋巴結(jié)之間。48h后進(jìn)行活體 或離體組織成像。

Laura Alanizetal., Cancer ImmunolImmunother.2011; 60(10):1383-95.

二．細(xì)胞因子療法
高純化或重組細(xì)胞因子生產(chǎn)的實(shí)現(xiàn)，為細(xì)胞因子在臨床的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。細(xì)胞因子療法是基于某 些細(xì)胞因子注射到體內(nèi)后可調(diào)節(jié)、增強(qiáng)一種或多種免疫細(xì)胞的功能，發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤免疫功能。目 前臨床上常用的細(xì)胞因子有白細(xì)胞介素 12（Interleukin-12,IL-12）、腫瘤壞死因-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、干擾素γ（Interferon-γ,IFN-γ) 及集落刺激因子（Colony Stimulating Factor ,CSF）等, 現(xiàn)細(xì)胞因子療法多與其他方式結(jié)合來(lái)進(jìn)行腫瘤的治療。
白細(xì)胞介素13（Interleukin-13,IL-13)是一種T細(xì)胞衍生的II型細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)程、新血管 形成、免疫監(jiān)視和腫瘤轉(zhuǎn)移方面扮演著重要的作用。IL-13可以結(jié)合IL-13Rα1和IL-13Rα2兩個(gè)受體亞型， 刺激下游信號(hào)通路級(jí)聯(lián)放大，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和細(xì)胞抑制效應(yīng)或腫瘤細(xì)胞死亡。其中IL-13Rα2已經(jīng)被 認(rèn)為是多種惡性腫瘤細(xì)胞系和病人腫瘤組織的標(biāo)志物，例如人類惡性膠質(zhì)瘤、頭頸癌、卵巢癌和腎細(xì) 胞癌等。因此靶向IL-13Rα2是一種合理的有前景的腫瘤治療手段。IL13-PE38由細(xì)胞因子IL-13和假單胞 菌外毒素（PE）的突變體組成，該復(fù)合物不僅對(duì)IL-13R2陽(yáng)性的腫瘤具有高毒性，在IL-13R2陰性的腫 瘤轉(zhuǎn)染表達(dá)IL-13R2后，IL13-PE38同樣具有很高的敏感性。利用Revvityr的IVIS系統(tǒng)即可對(duì)

IL13-PE38對(duì)腫瘤的治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)；結(jié)果顯示IL13-PE38和紫杉醇聯(lián)合對(duì)小鼠OSC-19舌腫瘤模型具 有很好的治療效果。


聯(lián)合用藥的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。OSC-19 (2×105 cells/30μl)接種到6周齡裸鼠舌頭的邊緣， 建立原位的口腔鱗狀癌模型，腫瘤接種5 天后可見(jiàn)明顯腫瘤。小鼠隨機(jī)分為兩組 （6-7只/組），在第8天開(kāi)始注射
IL13-PE38(100 μg/kg)，連續(xù)注射5天，隨后交 替3天注射紫杉醇(10 mg/kg/day)，并且分別在 第8天和第31天對(duì)腫瘤進(jìn)行成像。箭頭所指的 是淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移 (b) 生物發(fā)光信號(hào)進(jìn)行定量 分析代表腫瘤的生長(zhǎng)曲線。


Mitomu KioiInt etal.,Int J Cancer. 2009;124(6):1440–8.

IFN-λ 是由T 細(xì)胞產(chǎn)生，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、增加表面 MHC 抗原和腫瘤壞死因子的表達(dá)、抗 腫瘤血管生成等功能，在腫瘤臨床治療中應(yīng)用多年。使用 IFN-λ 質(zhì)粒能夠調(diào)節(jié)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，
從而達(dá)到抗腫瘤或感染性疾病的目的。通過(guò)尾靜脈注射大體積的質(zhì)粒 DNA（水動(dòng)力學(xué)注射方法）可引 起基因在嚙齒類動(dòng)物肝臟的表達(dá)，因此該注射方法在靶向肝臟轉(zhuǎn)移位點(diǎn)進(jìn)行基因遞送方面具有廣闊前 景。Atsuko Sato 在研究中利用Revvityr IVIS 成像系統(tǒng)評(píng)價(jià)了水動(dòng)力學(xué)注射的 IFN-λDNA 質(zhì)粒在小 鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型中的抗腫瘤效果。

通過(guò)水動(dòng)力學(xué)注射IFN-λ cDNA治療肝轉(zhuǎn)移。Luc-Colon26細(xì)胞通過(guò)門靜脈接種在BALB/c的肝臟。a.海參熒光素酶表達(dá)載體作 為共注射的對(duì)照Marker來(lái)驗(yàn)證水動(dòng)力學(xué)的可行性，在注射海參熒光素酶的底物后BALB/c小鼠肝臟產(chǎn)生了大量光子；b.在腹腔
注射螢火蟲(chóng)熒光素酶的底物后可監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)；c.通過(guò)測(cè)量肝臟的光子數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)luc-Colon26肝臟的轉(zhuǎn)移；d.IFN-λ延長(zhǎng)了肝 轉(zhuǎn)移小鼠的生存率；e.luc-B16/F10細(xì)胞毒性分析實(shí)驗(yàn)，C57BL/6J 小鼠通過(guò)皮下注射輻射滅活的cDNA-轉(zhuǎn)染的luc-B16/F10細(xì)胞 進(jìn)行免疫，隨后分離免疫小鼠的脾臟細(xì)胞，在E:T比例中作為效應(yīng)細(xì)胞。光子數(shù)代表不同處理后細(xì)胞的存活；f.評(píng)價(jià)肺癌轉(zhuǎn)移 模型中各方法的治療效果。
Atsuko Satoetal.,J Immunol.2006;176(12):7686-94.

三．抗體療法
腫瘤免疫藥物的開(kāi)發(fā)就技術(shù)成熟度和成功性來(lái)說(shuō)，抗體技術(shù)是碩果累累?？贵w進(jìn)行腫瘤的免疫治 療靶點(diǎn)主要是免疫檢驗(yàn)點(diǎn)，或者結(jié)合正向共刺激因子的激動(dòng)劑，例如西妥昔單抗（愛(ài)必妥）、帕尼單 抗（Vectibix）和曲妥珠單抗（赫賽?。┑??；蛘呓Y(jié)合負(fù)向共刺激因子的抑制劑，如熱點(diǎn)靶點(diǎn) CTLA-4、 PD-1 、PD-L1 等。 目前 CTLA-4 單抗（lpilimumab）和 PD-1 單抗（nivolumab）已經(jīng)先后被 FDA 批準(zhǔn)分 別用于治療晚期黑色素瘤和特定的轉(zhuǎn)移性鱗性非小細(xì)胞肺癌?，F(xiàn)在針對(duì)免疫檢驗(yàn)點(diǎn)的單抗開(kāi)發(fā)競(jìng)爭(zhēng)十分 激烈，如 lambrolizumab(PD-1)和 MPDL3280A(PD-L1)已經(jīng)進(jìn)入后期臨床，其他針對(duì) OX40 、4-1BB 的 多個(gè)單抗在早期開(kāi)發(fā)中。因?yàn)?T 細(xì)胞激活的靶點(diǎn)眾多，因此有望開(kāi)發(fā)出新的抗體藥物，擴(kuò)大腫瘤治療 的范圍。利用 Revvityr 的 IVIS 小動(dòng)物成像技術(shù)可無(wú)創(chuàng)地對(duì)抗體的治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)也可對(duì) 藥物的靶向分布進(jìn)行研究。

免疫檢驗(yàn)點(diǎn)共信號(hào)機(jī)制
1. 藥效評(píng)價(jià)
利用熒光素酶標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，并移植入動(dòng)物體內(nèi)建立腫瘤疾病動(dòng)物模型，應(yīng)用小動(dòng)物活體光學(xué)成 像技術(shù)觀測(cè)給藥后腫瘤光學(xué)信號(hào)的變化情況，進(jìn)而評(píng)價(jià)不同藥物、特定的給藥途徑、時(shí)間、劑量等給 藥策略對(duì)于腫瘤的治療效果，如下圖：

藥效評(píng)價(jià)研究：利用螢火蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記 MDA-MB-435 乳腺癌細(xì)胞株，將細(xì)胞注入小鼠腎包膜下構(gòu)建腎包膜腫瘤模型，進(jìn)而 對(duì) 3 種不同藥物或不同劑量的治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。（A,C）應(yīng)用 IVIS 成像系統(tǒng)長(zhǎng)期觀測(cè) 3 種藥物對(duì)腎包膜乳腺癌移植瘤的治 療效果，并進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示 30 mg/kg Docetaxel（TXT）對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制；（B,D）應(yīng)用 IVIS 成像系統(tǒng)長(zhǎng) 期觀測(cè) 3 種藥物對(duì)腎包膜乳腺癌移植瘤肺部轉(zhuǎn)移的抑制效果，并進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示 30 mg/kg Docetaxel（TXT）對(duì)腫瘤 轉(zhuǎn)移的抑制。
Zhang et al.,Clin Cancer Res.2009;15(1):238-46.
2. 觀測(cè)藥物靶向、分布及代謝
除了在藥效學(xué)中的應(yīng)用，小動(dòng)物活體光學(xué)成像也廣泛應(yīng)用于藥物在體內(nèi)靶向、分布及代謝的研究。 與藥效學(xué)中的應(yīng)用不同，此類應(yīng)用是以藥物為直接觀測(cè)對(duì)象，因此標(biāo)記方式通常是利用熒光探針直接 標(biāo)記藥物本身，通過(guò)追蹤熒光信號(hào)而反映藥物在體內(nèi)的分布情況。
例如在研究抗體或多肽類藥物是否能夠有效靶向腫瘤的實(shí)驗(yàn)中，可以利用熒光染料通過(guò)化學(xué)鍵的 結(jié)合標(biāo)記目標(biāo)抗體或多肽，經(jīng)尾靜脈注射后，利用小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)觀測(cè)上述標(biāo)記對(duì)象的腫瘤 靶向性，如下圖：

藥物的腫瘤靶向性研究：利用 VivoTag 645 熒光染料標(biāo)記抗癌藥物曲妥珠單抗(Trastuzumab)，尾靜脈注入攜帶 HER2 陽(yáng)性人 卵巢癌 SKOV3 的 SCID 小鼠體內(nèi)，通過(guò)熒光成像觀測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)藥物對(duì)腫瘤的靶向情況（左上圖后三列），腫瘤本身已被熒 光素酶標(biāo)記而通過(guò)生物發(fā)光成像（左上圖最左列），右上圖為熒光定量分析結(jié)果，標(biāo)明曲妥珠單抗對(duì) HER2 陽(yáng)性的人卵巢癌 SKOV3 具有良好靶向性。
在研究藥物靶向的同時(shí)，了解不同時(shí)間點(diǎn)藥物在動(dòng)物體各個(gè)器官的分布及最終代謝情況同樣。Revvityr 的 FMT 小動(dòng)物活體熒光斷層成像系統(tǒng)可以很好的滿足此類應(yīng)用需求。應(yīng)用FMT 成 像系統(tǒng)，能夠?qū)晒鈽?biāo)記的藥物在深層器官的分布進(jìn)行斷層掃描及三維重建，獲得真實(shí)準(zhǔn)確的三維定 量數(shù)據(jù)，進(jìn)而對(duì)藥物的體內(nèi)分布代謝情況作出正確分析。如下圖：

上圖左：利用 FMT 成像系統(tǒng)觀測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)熒光染料 VivioTag 680 標(biāo)記的 BSA 在小鼠不同器官的分布；上圖右：不同時(shí) 間點(diǎn)不同器官 BSA 分布的定量結(jié)果。
四．過(guò)繼性免疫細(xì)胞療法
過(guò)繼性免疫細(xì)胞治療（adoptive cell transfer therapy ，ACT），是指從腫瘤患者體內(nèi)分離免疫活性細(xì) 胞，在體外進(jìn)行擴(kuò)增和功能鑒定，然后向患者回輸，從而達(dá)到直接殺傷腫瘤或激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答殺 傷腫瘤細(xì)胞的目的。ACT 分為非特異性免疫治療（如CIK 細(xì)胞治療、LAK 療法）及特異性免疫治療（如

嵌合抗原受體 T 細(xì)胞免疫療法，CAR-T）。尤其是 CAR-T 細(xì)胞療法已經(jīng)成為細(xì)胞療法中的熱點(diǎn)，其中 Novartis 團(tuán)隊(duì)主導(dǎo)的二期臨床實(shí)驗(yàn)取得了迄今腫瘤免疫界結(jié)果，在三十個(gè)病人中，二十七患者已 經(jīng)沒(méi)有臨床腫瘤的癥狀和腫瘤的指征。而在國(guó)內(nèi)北大國(guó)際醫(yī)院等機(jī)構(gòu)也都在進(jìn)行CAR-T 細(xì)胞治療研究， 并已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。
人類NK細(xì)胞，在抗腫瘤中起著重要的作用，代表表達(dá)CD3-/CD56+ 的大顆粒淋巴細(xì)胞群。NK細(xì)胞 通過(guò)NK細(xì)胞受體和靶細(xì)胞配體之間的相互作用來(lái)區(qū)分正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染TNF配體超家族成 員的41BBL和IL15的K562細(xì)胞（K562-mb15-41BBL）經(jīng)輻射滅活后能夠刺激NK細(xì)胞高度活化并大量的 擴(kuò)增。經(jīng)K562-mb15-41BBL活化的NK細(xì)胞高表達(dá)IFN-γ、TNF等。Tarun K等研究了這種NK細(xì)胞體系對(duì) 多發(fā)性骨髓瘤的治療作用。研究中將穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素的白血病細(xì)胞系OPM2接種在
NOD/scid/IL2Rγnull小鼠皮下后，利用Revvityr IVIS小動(dòng)物活體成像技術(shù)可實(shí)時(shí)檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)，從 而對(duì)exp-NK細(xì)胞的療效進(jìn)行評(píng)價(jià)。

NOD/scid/IL2Rγnull-hu模型中，exp-NK細(xì)胞顯著抑制轉(zhuǎn)染熒光素酶基因的OPM2骨髓瘤的生長(zhǎng)。(A)3×105OPM2-luc細(xì)胞皮下 接種，7天后可見(jiàn)明顯腫瘤。隨后分別給予PBS和總劑量160×106 exp-NK細(xì)胞（分4次注射，間隔48h）進(jìn)行處理，并在不同時(shí) 間點(diǎn)對(duì)腫瘤進(jìn)行生物發(fā)光成像（Day0代表NK細(xì)胞注射的時(shí)間）。#1.一周兩次靜脈注射 IL2 (100 U)，延長(zhǎng)模型小鼠存活時(shí)間；
(B)各組相對(duì)體積進(jìn)行比較，結(jié)果顯示與對(duì)照和低劑量組相比160×106 exp-NK細(xì)胞治療組腫瘤體積最小。 Tarun K..et al.haematologica.2012;97(9):1348-57.

繼發(fā)性T細(xì)胞對(duì)于治療多種癌癥具有很好的前景，但是臨床應(yīng)用時(shí)遇到一個(gè)問(wèn)題，即如何將靶向淋 巴細(xì)胞遞送到腫瘤位點(diǎn)并在免疫抑制的微環(huán)境中擴(kuò)增。Stephan在研究中設(shè)計(jì)了一個(gè)具有生物活性的多 聚物，通過(guò)將移植物置于無(wú)法手術(shù)的腫瘤附近或部分切除腫瘤的切除位點(diǎn)，能夠遞送、擴(kuò)增和分散腫 瘤激活的T細(xì)胞。利用螢火蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，甲殼蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記腫瘤特異性T細(xì)胞，使用
Revvityr IVIS成像系統(tǒng)即可監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)及T細(xì)胞的分布。成像結(jié)果顯示在小鼠乳腺癌切除模型 中移植物能夠有效的支持腫瘤靶向的T細(xì)胞通過(guò)切除位點(diǎn)與淋巴結(jié)交集，減少腫瘤的復(fù)發(fā)。在多病灶的 卵巢癌轉(zhuǎn)移模型中多聚物遞送的T細(xì)胞能夠?qū)е履[瘤的退化，而只用腫瘤活化的T細(xì)胞進(jìn)行治療時(shí)效果 甚微。

不同處理方式下腫瘤和T細(xì)胞的成像，建立小鼠4T1-luc乳腺癌脂肪墊模型，乳腺癌特異性T細(xì)胞分離自經(jīng)輻射滅活的4×106 4T1 B7.1/4-1BBL免疫的BALB/c小鼠（輔助CpG基序的寡脫氧核苷酸和Poly(I:C)），獲取的特異性T細(xì)胞經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式 獲得CBR-LUC基因，成像前分別注射F-luc和CBR-luc的底物進(jìn)行腫瘤或T細(xì)胞的生物發(fā)光成像。

不同處理方式下腫瘤和T細(xì)胞的成像， 建立小鼠ID8-VEGF-luc卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移模型，為了獲得卵巢癌特異性（NKG2D CAR-transduced）T細(xì)胞，取C57BL/6J小鼠的脾臟，過(guò)濾后重懸于裂解液中，分離的脾細(xì)胞使用含1 ng/ml interleukin-7和2μg/ml Concavalin A的培養(yǎng)基RPMI1640培養(yǎng)，并純化獲得CD8+效應(yīng)T細(xì)胞， CD8+效應(yīng)T細(xì)胞先后轉(zhuǎn)染NKG2D-CAR基因和 CBR-luc。成像前分別注射F-luc底物和CBR-luc的底物進(jìn)行腫瘤或T細(xì)胞的生物發(fā)光成像。
Sirkka B Stephan etal.,nature biotechnology.2015;33(1):97-104.

多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤是有侵略性的原發(fā)性腦瘤。目前來(lái)說(shuō)，手術(shù)切除結(jié)合放射和化學(xué)療法是 治療多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤方法。然而對(duì)于中老年患者，放射和化學(xué)治療只能減緩而不能阻止腫 瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。CD133+腫瘤干細(xì)胞的化學(xué)和放射療法耐藥性能夠解釋傳統(tǒng)療法低效率的原因。正位異種 移植螢火蟲(chóng)熒光素酶標(biāo)記的患者來(lái)源的多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞到免疫缺陷小鼠（SCID）前額葉，建 立多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤小鼠模型。腫瘤內(nèi)注射 HER2 靶向的嵌合性 T 細(xì)胞，Revvityr 的 IVIS 系統(tǒng) 成像顯示經(jīng)過(guò)特異性 HER2+T 細(xì)胞治療小鼠的生物發(fā)光明顯下降（下圖）。結(jié)果說(shuō)明特異性 HER2+T 細(xì) 胞能夠抑制多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)，從而對(duì)多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者進(jìn)行有效治療。

上圖：首行（沒(méi)有治療的多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤小鼠）中行（T 細(xì)胞治療多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤小鼠）末行（特異性 HER2+ T 細(xì) 胞治療多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤小鼠）。

Ahmed et al, Clinical Cancer Research, 2010;16(2):474-86.