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Revvity小動物活體光學(xué)成像技術(shù)已在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床前醫(yī)學(xué)研究及藥物 研發(fā)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在眾多應(yīng)用領(lǐng)域中，免疫研究是活體光學(xué)成像技術(shù)的應(yīng)用熱 點之一。在應(yīng)用活體光學(xué)成像技術(shù)進行免疫學(xué)研究中，常用的標(biāo)記方法及應(yīng)用領(lǐng)域包括 ：1、利用功能性探針監(jiān)測免疫疾病的發(fā)生發(fā)展及相關(guān)治療；2、利用熒光素酶基因或熒 光染料標(biāo)記免疫細胞，監(jiān)測免疫細胞的免疫應(yīng)答作用；3、利用熒光素酶作為報告基因 標(biāo)記疾病相關(guān)基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物，進行免疫疾病機理研究。下面結(jié)合一些具體實例進 行闡述：

一.監(jiān)測免疫疾病的發(fā)生發(fā)展及治療效果

伴隨免疫疾病研究的深入，目前已開發(fā)出一系列針對免疫疾病監(jiān)測的功能性探針， 這些探針的設(shè)計大多是基于在免疫疾病中表達的特征性分子或酶，通過對特征性分子或 酶的監(jiān)測而反映疾病的發(fā)生發(fā)展。利用這些探針并結(jié)合活體光學(xué)成像技術(shù)，研究者可以 方便快捷地在活體動物水平監(jiān)測免疫疾病的發(fā)生發(fā)展及治療效果。

如在各種炎性疾病的發(fā)生發(fā)展中，通常會伴隨大量活性氧自由基（ROS）及氧化脅 迫的產(chǎn)生。研究者根據(jù)上述特征，設(shè)計出能夠特異性探測 ROS 或氧化脅迫相關(guān)酶的功 能性探針用于炎性疾病的檢測。Lee等應(yīng)用其自行研發(fā)的表面結(jié)合透明質(zhì)酸的金納米顆 粒（HA-AuNPs）成功檢測了小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。該納米顆粒表面結(jié)合了熒光染料標(biāo)記 的透明質(zhì)酸，當(dāng)未被激活時，由于熒光染料及納米顆粒本身的相互作用而處于熒光湮滅 狀態(tài)，而表面結(jié)合的透明質(zhì)酸一旦被 ROS 或透明質(zhì)酸酶剪切，便會被外界光源激發(fā)而 發(fā)光。應(yīng)用該探針并結(jié)合活體光學(xué)成像技術(shù)，便可在活體動物水平靈敏監(jiān)測到炎性疾病 的發(fā)生。

Revvity依靠強大的生物學(xué)研發(fā)團隊，成功開發(fā)出多種應(yīng)用于炎性疾病監(jiān)測的功能 性探針，如用于探測炎性細胞中髓過氧化物酶（MPO）的化學(xué)發(fā)光 （Chemiluminescent）探針“XenoLight® RediJect™ Inflammation Probe"、用于探測環(huán) 氧酶2（COX-2）的近紅外熒光探針“XenoLight®RediJect™COX-2 Probe"、用于探測 炎性細胞中組織蛋白酶（Cathepsin）的近紅外探針“ProSense 680/750"、用于探測炎性 細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase）的近紅外探針“MMPSense 680/750"、 用于探測嗜中性粒細胞胰肽酶（Neutrophil Elastase）的近紅外探針“Neutrophil Elastase 680 FAST"。這些探針已被廣泛應(yīng)用于各種炎性疾病的研究中。

二.監(jiān)測免疫細胞的免疫應(yīng)答

免疫應(yīng)答是機體免疫系統(tǒng)對抗原刺激所產(chǎn)生的以排除抗原為目的的生理過程。這個 過程是免疫系統(tǒng)各部分生理功能的綜合體現(xiàn)，包括了抗原遞呈、淋巴細胞活化、免疫分 子形成及免疫效應(yīng)發(fā)生等一系列的生理反應(yīng)。通過有效的免疫應(yīng)答，機體得以維護內(nèi)環(huán) 境的穩(wěn)定。免疫細胞在機體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，了解免疫細胞的作用機理是 免疫學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)?；铙w光學(xué)成像技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫細胞的相關(guān)研究，通過該 技術(shù)可以在活體動物水平監(jiān)測免疫細胞在相關(guān)疾病中的遷移、分布及功能。目前用于標(biāo) 記免疫細胞的主要方法包括：1、通過帶有熒光素酶基因或熒光蛋白基因的病毒載體穩(wěn) 定轉(zhuǎn)染人源或鼠源免疫細胞，使免疫細胞具有發(fā)光性質(zhì)；2、直接從轉(zhuǎn)基因發(fā)光小鼠中 提取免疫細胞，所獲得的免疫細胞即有發(fā)光性質(zhì)；3、通過特定的熒光染料直接標(biāo)記免 疫細胞使其具有發(fā)光性質(zhì)。研究者可根據(jù)具體研究，選擇合適的標(biāo)記方法對免疫細胞進 行標(biāo)記。

利用帶有熒光素酶基因的病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染免疫細胞的好處在于：1、生物發(fā)光靈 敏度高，可以滿足少量被標(biāo)記免疫細胞的活體觀測；2、由于是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，因此發(fā)光特 性可以傳代，不會因為細胞的分裂或分化而改變，可以進行數(shù)周或更長時間的觀測。

如Rabinovich 等人利用增強型螢火蟲熒光素酶基因（effluc）標(biāo)記T細胞，發(fā)現(xiàn)其 發(fā)光強度比傳統(tǒng)螢火蟲熒光素酶（ffluc）高出至少100倍，將標(biāo)記的T細胞皮下移植后， 利用IVIS系統(tǒng)能夠非常靈敏的觀測到3個細胞發(fā)出的光信號。

Santos 等利用橈足類動物膜結(jié)合型熒光素酶基因（ext GLuc）標(biāo)記T細胞，發(fā)現(xiàn)其 發(fā)光強度較螢火蟲熒光素酶（ffluc）及海腎熒光素酶（Rluc）均有大幅提升。另外，研 究者將ext GLuc標(biāo)記的T細胞尾靜脈注射入攜帶淋巴瘤A20（OVA）的SCID小鼠體 內(nèi)，應(yīng)用IVIS系統(tǒng)對T細胞在體內(nèi)的分布進行長期觀測，發(fā)現(xiàn)T細胞能夠有效靶向腫 瘤，并對腫瘤細胞具有殺傷作用。

通過上述帶有熒光素酶基因的病毒載體在體外轉(zhuǎn)染免疫細胞，需要一定的實驗基礎(chǔ) 及操作成熟度，并且與腫瘤細胞相比，免疫細胞的轉(zhuǎn)染效率較低，沒有成熟的實驗操作 經(jīng)驗較難獲取熒光素酶高表達的轉(zhuǎn)染細胞株。而通過從組成型（ubiquitous）表達或特異 性（inducible）表達熒光素酶基因的轉(zhuǎn)基因發(fā)光小鼠中提取免疫細胞的方法相對方便， 無需自行進行標(biāo)記，用提取的具有發(fā)光性質(zhì)的免疫細胞即可開展實驗。目前市場上已有 多種商業(yè)化的發(fā)光轉(zhuǎn)基因小鼠供研究者選擇購買，如用組成型表達啟動子控制熒光素酶 基因表達而構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠Tg(β-actin-luc)和Tg(CMV-luc)，其全身均有熒光素酶的表 達，因此從脾、淋巴結(jié)、胸腺、骨髓等提取的免疫細胞即具備發(fā)光性質(zhì)。

Cheeran 等利用從轉(zhuǎn)基因小鼠Tg(β-actin-luc)中提取的脾細胞及淋巴結(jié)細胞，研究了 免疫細胞對病毒感染的響應(yīng)。研究者將提取的發(fā)光脾細胞及淋巴結(jié)細胞通過尾靜脈注入 腦室內(nèi)感染巨細胞病毒的小鼠，利用 IVIS 系統(tǒng)觀測了上述免疫細胞在活體動物體內(nèi)對 感染病灶點的浸潤。結(jié)果顯示，在未經(jīng)病毒感染的正常小鼠體內(nèi)，移植的淋巴細胞主要 聚集于脾內(nèi)（如下圖-1dpi所示），而當(dāng)小鼠腦部感染病毒后，這些淋巴細胞會遷移至感 染區(qū)域而發(fā)揮免疫作用。

Chewning 等構(gòu)建了利用T細胞特異性表達的人CD2基因啟動子控制熒光素酶基因 表達的表達載體，并應(yīng)用該載體構(gòu)建出轉(zhuǎn)基因小鼠，從該轉(zhuǎn)基因小鼠中提取的發(fā)光細胞 即為T細胞。研究者將提取的發(fā)光T細胞經(jīng)尾靜脈注入由OVA誘導(dǎo)而引發(fā)炎癥的小鼠 體內(nèi)，應(yīng)用IVIS系統(tǒng)觀測T細胞的免疫應(yīng)答。

除了上述兩種通過熒光素酶基因?qū)γ庖呒毎M行標(biāo)記的方法之外，通過膜嵌合型熒 光染料標(biāo)記免疫細胞的方法則更為簡便，研究者只需依據(jù)染料標(biāo)記的實驗流程，即可自 行完成對免疫細胞的標(biāo)記。目前市場上主要的膜嵌合型熒光染料包括 DiD、DiL、DiR 等，它們均是通過自身親脂性的長碳鏈插入目標(biāo)細胞的細胞膜中而進行標(biāo)記。使用此種 方式進行標(biāo)記的好處在于操作相對簡單，但由于是膜嵌合性標(biāo)記，因此被標(biāo)記細胞的發(fā) 光性質(zhì)不會傳代，只能用于觀測免疫細胞在體內(nèi)的短時間動態(tài)變化。

之前的研究顯示，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展通常伴隨有腫瘤周邊的炎癥發(fā)生，而炎性細胞 在腫瘤周邊炎癥區(qū)域的聚集是炎癥發(fā)生的必要條件。Sista 等利用DiD染料體外標(biāo)記了 單核細胞，并利用 IVIS 系統(tǒng)觀測了尾靜脈注射的單核細胞對原發(fā)性乳腺癌的靶向聚集 情況。

三.免疫疾病機理研究

對于炎性相關(guān)基因的研究，可以揭示免疫疾病的分子機理，更好的了解免疫疾病的 發(fā)生發(fā)展及相關(guān)治療。小動物活體光學(xué)成像技術(shù)已越來越多的應(yīng)用于此類研究。研究者 通過構(gòu)建各種生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因動物，結(jié)合活體光學(xué)成像技術(shù)，在活體動物水平觀測免疫 疾病發(fā)展過程中相關(guān)基因的表達。目前市場上已有不少成熟的可用于炎癥研究的生物發(fā) 光轉(zhuǎn)基因小鼠，這些小鼠的構(gòu)建通常是用炎性相關(guān)基因的啟動子特異性控制熒光素酶基 因的表達，從而通過發(fā)光情況反映炎癥的發(fā)生及治療效果。下圖列舉了幾種可應(yīng)用于相 關(guān)免疫疾病研究的生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因小鼠模型，研究者可以從美國Taconic公司購買。

NFκB 是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫反應(yīng)的早期和炎癥反應(yīng)各階段的許多分子 都受NF-κB 的調(diào)控，因此，對于 NFκB 信號通路的研究是炎癥疾病研究的一個熱點。 Paur 等利用Tg(NFκB-RE-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠，觀測了咖啡對LPS誘導(dǎo)的炎癥的抑制作用。 結(jié)果顯示，咖啡能夠抑制NFκB的表達，并激活機體的抗氧化防御，而且隨著咖啡烘焙 程度的提高，這種抑制效應(yīng)越明顯。因此，利用Tg(NFκB-RE-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠可以觀測 炎癥的發(fā)生發(fā)展及相關(guān)藥物的治療效果。

一氧化氮（NO）是細胞內(nèi)的一種具有生物活性的重要調(diào)節(jié)分子，它既是是組織損 傷的誘發(fā)因子和各種病變的增強因子，也是免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)性分子。在炎性條件下，體 內(nèi)NO主要由炎性細胞中的誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶（iNOS）產(chǎn)生，在敗血癥、關(guān)節(jié)炎、 心血管疾病等多種炎性疾病中起調(diào)節(jié)作用。LPS及多種細胞因子如干擾素IFN-γ等可激 活iNOS的表達。下圖所示為應(yīng)用Tg(iNos-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠觀測不同抗炎藥物對iNOS表 達的抑制效應(yīng)。研究者利用LPS誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，對iNOS特異性表達的轉(zhuǎn)基因小鼠施 加不同抗炎藥物，應(yīng)用IVIS系統(tǒng)觀測了不同抗炎藥物對iNOS表達的抑制效果。

Cordeau 等利用Tg(GFAP-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠，監(jiān)測GFAP在肺炎鏈球菌感染而引發(fā)的 腦膜炎中的表達。研究者用細菌熒光素酶（bacterial luciferase）基因標(biāo)記肺炎鏈球菌， 以監(jiān)測細菌在活體動物體內(nèi)的感染情況，同時以螢火蟲熒光素酶基因標(biāo)記的 Tg(GFAP-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠為實驗動物，觀測GFAP在肺炎鏈球菌感染而引發(fā)的腦膜炎中 的表達，以及經(jīng)抗生素治療后細菌的感染情況和GFAP的表達情況。結(jié)果顯示，隨著細菌感染程度及范圍的升高和擴大，GFAP的表達量也相應(yīng)升高；而經(jīng)抗生素治療后，細 菌的感染情況明顯被抑制，GFAP的表達量也隨之降低。對小鼠感染腦部的體外成像結(jié) 果顯示，細菌對于腦部局部區(qū)域的感染，能引發(fā)整個腦部GFAP的大量表達。

Luo 等利用Tg(GFAP-luc)及Tg(SBE-luc) 轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)合活體光學(xué)成像技術(shù)，觀 測了在自身免疫性腦脊髓炎（EAE）中與 GFAP 表達相關(guān)的星形膠質(zhì)細胞的聚集及與 TGF-β 信號通路相關(guān)的炎癥的發(fā)生。研究者用髓磷脂少突細胞糖蛋白（MOG）免疫小 鼠，引發(fā)實驗性自身免疫性腦脊髓炎，隨后，利用IVIS系統(tǒng)觀測患病Tg(GFAP-luc)及 Tg(SBE-luc)轉(zhuǎn)基因小鼠中 GFAP 及 TGF-β 的表達情況。結(jié)果顯示，小鼠免疫后的第 7 天，即可觀測到GFAP 及TGF-β 表達量顯著升高，說明在腦脊髓炎的發(fā)病初期，即伴 隨有星形膠質(zhì)細胞的聚集以及炎癥的發(fā)生。值得注意的是，腦脊髓炎的明顯臨床癥狀出 現(xiàn)于免疫后11 天，因此，與觀察臨床癥狀而診斷疾病發(fā)生的方法相比，通過應(yīng)用活體 光學(xué)成像技術(shù)觀測疾病相關(guān)基因的表達，能夠更早的觀測到疾病的發(fā)生。