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隨著科研水平的日益發(fā)展，對于疾病及相關治療的研究已越來越多的由體外分子及 細胞水平轉移到活體動物水平層面，而傳統(tǒng)的儀器和方法很大程度限制了研究人員在活 體動物水平直接監(jiān)測疾病的整體發(fā)展過程以及新藥的臨床前研發(fā)。因此，構建基于活體 動物水平的新型研究平臺是開展疾病研究及藥物研發(fā)的重要基礎。小動物活體光學成像 系統(tǒng)是將分子及細胞生物學技術從體外研究水平發(fā)展到活體動物研究水平的前沿性臨 床前分子影像技術，該技術通過采用生物發(fā)光與熒光探針標記研究對象，借助靈敏的光 學檢測儀器，直接在活體動物水平監(jiān)測疾病的發(fā)展變化并開展相關藥物的臨床前研發(fā)。 由于光學成像因為操作簡單、靈敏度高、不涉及到放射性等優(yōu)勢， 已被越來越廣泛地 應用于臨床前疾病研究的各個領域，包括癌癥研究、器官損傷研究、心血管疾病研究、 神經疾病研究、炎癥疾病研究、免疫學及干細胞研究等。在新藥的臨床前研發(fā)階段，全 球藥企都已將小動物活體光學成像技術應用于藥效和安全性評價研究、藥物的靶向 及生物分布研究、新型藥物載體的研發(fā)等新藥臨床前研究的多個方面。光學成像因為操 作簡單、靈敏度高、不涉及到放射性等優(yōu)勢，應用非常廣泛，包括生命科學、藥學和材 料學等眾多領域。同樣小動物活體光學成像技術在肝損傷領域也發(fā)揮著重要的作用。四 氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)是一種強烈的能夠引起肝細胞壞死的化合物，一直被研 究者用來誘發(fā)各種肝損傷模型以闡明化合物肝毒性機制或肝損傷保護機制。CCl4會引 起氧化應激反應，從而引起自由基變化、引發(fā)與環(huán)氧化酶（COX）介導的炎癥反應相關 反應，CCl4自身的溶酶作用可導致肝細胞損傷等，通過小動物活體光學成像技術即可 在活體狀態(tài)下檢測肝臟損傷時細胞和分子水平的這些生物過程，并可對治療肝損傷的藥 物和干細胞等的治療效果和分布、靶向等進行評價。以下是詳細的闡述。

一.利用熒光指示探針檢測肝臟的氧化損傷

氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內高活性分子如活性氧自由基 （reactive oxygenspecies,ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogen species,RNS）產生過 多，氧化程度超過氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導致組織損傷。大 量的研究顯示，氧化應激參與了多種肝臟疾病的形成發(fā)展過程，例如酒精性和非酒精性 脂肪肝、病毒性肝炎、肝纖維化、肝癌、缺血再灌注的損傷。斯坦福大學Shuhendler教 授在2014年發(fā)表一篇文章，在文章中就設計并研發(fā)了一種肝臟氧化損傷的指示劑。其原 理正是基于肝損傷的兩個關鍵生物標志物——ROS和RNS，二者的產生機制不同，因此 對兩者同時檢測可廣泛的檢測疾病、化合物、藥物等對肝臟造成的氧化損傷及對不同治 療方法的效果做出評價。此指示劑是一種半導體聚合物納米粒（semiconducting polymer nanoparticle,SPN），包含三個核心元件：（1）靶向元件：通過聚乙二醇聯(lián)連接半乳糖 殘基，可以與肝細胞表面的半乳糖受體結合，是一種常見的肝靶向方法；（2）活性氧 感應元件：化學發(fā)光劑雙草酸酯（CPPO）在活性氧存在的條件下，迅速分解產生高能 中間體1,2-二氧雜環(huán)丁烷二酮，激發(fā)附近染料分子發(fā)光，檢測發(fā)出的光子強度即可評活性氧的程度；（3）活性氮感應元件：青色素染料IR775S發(fā)射680nm、820nm兩種熒光， 因熒光能量偏振轉移（FRET），發(fā)射的680nm的光子作為激發(fā)光激發(fā)染料分子發(fā)射出 820nm的光，而680nm光子減弱甚至消失；而在活性氮存在的條件下，F(xiàn)RET現(xiàn)象消失 680nm熒光信號增強，檢測此信號的強度即可評價活性氮的強度。

二.利用水動力學模型檢測肝臟損傷

水流動力學注射（hydrodynamic-based procedure）是一種高效的基因轉移方式，即 將約小鼠體重8-10%的質粒DNA溶液在短時間內快速注射到小鼠體內，這種方法能讓 表達載體穩(wěn)定存留在肝臟一段時間并進行表達。水動力注射是非常成熟的方法，軍事醫(yī) 學科學院詹林盛研究員就利用水動力學模型開展了一系列圍繞肝臟疾病的研究，例如丙 型肝炎、肝臟毒物代謝等，已經成功建立了多種小鼠肝臟熒光素酶調控模型。例如詹林 盛研究員在2013年建立了在活體水平檢測肝臟NF-κB表達的模型小鼠。NF-κB信號通 路在維持機體正常的生理功能中起到很重要的作用。經典的NF-κB信號通路與基體的 自身免疫有關，而炎癥反應是自身免疫反應的重要表現(xiàn)形式，因此NF-κB的表達可以 代表炎癥的發(fā)生和發(fā)展。同樣在CCl4誘導產生急性肝損傷中，NF-κB信號通路會被激 活。在實驗中將pattB-NF-κB-Fluc 報告載體和φC31o整合酶載體通過水動力學方式注射 到小鼠體內，在整合酶的作用下pattB-NF-κB-Fluc會重組到肝細胞的染色體中，這樣就 可以實時監(jiān)測NF-κB在肝臟的激活表達情況，從而達到判斷肝臟的損傷程度及藥物治 療效果的目的。

細胞凋亡是CCl4造成肝損傷的另一個機制，而caspase-3被認為是最終的凋亡執(zhí)行分 子，詹林盛研究員同樣用水動力學注射方法建立了實時監(jiān)測肝臟細胞凋亡的模型小鼠， 該模型是attB-ANLuc(DEVD)BCLuc和φC31o整合酶載體采用水動力學方式注射到小鼠 體內，同樣在整合酶的作用下，attB-ANLuc(DEVD)BCLuc會重組到肝臟細胞的染色體 中穩(wěn)定表達。ANLuc(DEVD)BCLuc是將熒光素酶基因的N端和C端分別連上能夠相互作 用的蛋白A、B的基因，兩者之間以caspase-3識別位點相連，當肝臟未發(fā)生凋亡時caspase-3 不表達，熒光素酶的N端和C端由于空間位置受阻無法形成完整的熒光素酶結構，不能 催化底物反應產生發(fā)光信號，而一旦凋亡發(fā)生caspase-3隨即表達就會將熒光素酶的N端 和C端之間的肽段去除，在A、B蛋白的相互作用下，就會形成完整的熒光素酶結構，能 夠與底物反應產生發(fā)光信號。利用該小鼠模型即可實時檢測caspase-3的表達，從而評價 肝臟細胞的凋亡。

三.利用轉基因小鼠檢測肝損傷

CRISPR/Cas9等轉基因技術的出現(xiàn)，使得建立轉基因小鼠的成本大大降低，同時也 縮短了轉基因小鼠構建的周期，因此更利于利用轉基因小鼠或大鼠的模型來對疾病發(fā)生 機制及治療效果等進行研究。將熒光素酶的報告基因插入與肝臟損傷相關的基因的啟動 子下建立轉基因小鼠，即可在活體狀態(tài)下，利用光學成像的方式對肝臟損傷進行實時動 態(tài)的檢測。

血紅素氧化酶（Heme oxygenase，HO）是一種催化血紅素的起始酶和限速酶，有 著重要的生物作用。HO在體內主要有三種同工酶形式，即HO-1、HO-2和HO-3。這 三中酶是不同基因的表達產物，但均能作用于血紅素將其分解產生相同摩爾數(shù)的生物活 性分子：一氧化碳、膽紅素和鐵離子。其中HO-1又稱為熱休克蛋白32是生物體內最 容易被誘導產生的抗氧化酶，HO-1在多數(shù)組織中不表達或低表達，但低氧、激素、氧 化劑等因素均能誘導其表達，能夠調節(jié)細胞生理功能而發(fā)揮抗感染、抗氧化、抗細胞增 殖等作用，在眾多疾病中發(fā)揮重要的生物學功能。研究發(fā)現(xiàn)，當小鼠或大鼠經腹腔注射 CCl4 建立急性肝損傷模型后，在注射CCL4 3小時后HO-1開始表達，12h時到達峰值， 而正常肝臟組織中未見HO-1表達，因此HO-1的表達水平可以作為肝損傷的一個指標， 從而來鑒定肝臟損傷程度及藥物的治療效果。將熒光素酶的基因插入小鼠HO-1基因啟 動子下游建立HO-1-Luc轉基因小鼠，即可應用生物發(fā)光的成像模式實時檢測HO-1基 因的表達。

上圖左.HO-1-luc模型小鼠在尾靜脈或者腹腔注射CdCl2（10 μM）后HO-1表達隨時間的變化， A左.尾靜脈 注射CdCl2或PBS后進行長時間檢測，并且當CdCl2組HO-1表達接近對照組時，重新注射CdCl2，A右.尾靜脈 與腹腔注射CdCl2進行比較；B、C分別為尾靜脈或腹腔注射CdCl2后進行生物發(fā)光成像的圖像。右.不同劑量 CdCl2在尾靜脈注射9小時后，模型小鼠正面和背面的生物發(fā)光圖像，從上到下劑量分別為(control,5, 10, and 20 μmol/kg).Weisheng Zhang.et al.J Mol Med (2002) 80:655–664

血清淀粉樣蛋白A(Serum amyloid A,SAA)是一種急性期反應蛋白，血中濃度主要由 合成速度決定，而肝功能正常時其合成主要決定于細胞因子的水平。當組織發(fā)生感染、 炎癥或者損傷時，SAA可以誘導產生組織損傷修復過程所需的酶，吸引免疫細胞到達炎 癥部位加強免疫反應作用。若外源的藥物或化合物會引發(fā)機體產生損傷或炎癥時，SAA 的表達會迅速上升，因此SAA也可以作為肝臟損傷的一個標志物。同樣我們建SAA-Luc 轉基因小鼠同樣實時檢測SAA的表達，從而肝臟的損傷程度。

上述例子中提到CCl4誘導產生急性肝損傷中，NF-κB信號通路會被激活，因此我 們可以構建NF-κB-Luc轉基因小鼠，通過生物發(fā)光成像模式即可實時檢測 NF-κB的表 達，同樣也可以達到判斷肝臟的損傷程度及藥物治療效果的目的。例如下圖就利用 NF-κB-Luc 轉基因小鼠模型評價了牛樟芝對肝臟損傷的預防作用。從下圖可以看出，LPS 注射后，腹腔出現(xiàn)很強的生物發(fā)光信號，其信號主要來源于肝臟，而經牛樟芝預防組則 信號明顯弱于LPS誘導組，從而說明牛樟芝對LPS引起的肝臟的炎癥損傷有一定的預 防效果。

（A）應用LPS（脂多糖），LPS+A. camphorate（脂多 糖和牛樟菇），Mock（陰性對照）經腹腔注射后，小 鼠生物發(fā)光和定量結果。(B) 體外Spleen（胰臟）Liver （肝臟）Kidney（腎臟），Mesenteric lymph nodes (腸 系膜淋巴結)，Small intestine (小腸) 的生物發(fā)光成像。 Hseu et al, Food and Chemical Toxicity,

四.利用光學探針檢測肝臟的炎癥反應

CCl4 腹腔注射后炎癥相關的金屬蛋白酶（MMP）-2和-9的表達增高，因此應用特 異性MMP敏感的熒光探針同樣可以監(jiān)測肝臟炎癥發(fā)生發(fā)展及評價藥物的治療或預防效 果。該探針的原理是兩個熒光基團通過MMP的底物肽段連接，此時由于二者接近，熒 光基團相互抑制，不能產生熒光信號，而當探針進入MMP高表達的炎癥位點時，MMP 就會水解熒光基團之間的肽段，兩個熒光基團分開產生熒光。而目前市場已有商品化的 熒光探針對MMP表達進行檢測，此時熒光信號的強度可以反應炎癥嚴重程度。

五．檢測治療性藥物或干細胞在肝臟的分布

愈來愈多的證據(jù)表明，在適當?shù)拇碳は拢琈SCs在體外可以分化為正常的肝細胞， 因此間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植在治療肝損傷中有著很好的前 景。利用小動物活體光學成像系統(tǒng)，對MSCs在急性肝損傷小鼠體內進行動態(tài)示蹤，了 解MSCs在小鼠體內遷移、分布和定植情況，從而在臨床前動物水平評價MSCs移植治療 肝損傷的可行性，并對注射劑量、注射次數(shù)、注射方式等變量進行研究。例如中山大學 第三附屬醫(yī)院的研究人員就將熒光素酶標記的MSCs通過不同的方式移植入肝損傷受體 小鼠的體內，通過生物發(fā)光成像的方式檢測了MSCs在模型小鼠內的分布情況，結果發(fā) 現(xiàn)不同的移植方式MSCs的分布不同，經下腔靜脈注射主要分布在小鼠肺部、經腸系膜 上靜脈和心內注射的方式主要分布在肝臟。

同樣采用熒光染料對治療肝損傷的藥物或藥劑進行標記后，即可通過熒光成像的方 式實時監(jiān)測藥物對肝臟的靶向性及在動物體內的分布代謝情況。例如，Sun-Jung Kim 就設計了一種靶向肝臟的siRNA載體復合物，該復合物由以聚乙酰亞胺（PEI）為骨架， N-氨基葡糖胺(GlcNAc)為靶頭（特異性靶向肝纖維化位點），ICG作為熒光指示劑，該 載體可攜帶siRNA用于肝纖維化的成像和治療，在文章中Sun-Jung Kim利用小動物活體 光學成像技術評價了該載體對肝臟的靶向效果和實時分布。

綜上所述，小動物活體光學成像技術可以在活體狀態(tài)下，在細胞和分子水平實時動 態(tài)的監(jiān)測肝損傷發(fā)生、發(fā)展的整個過程，并對藥物或干細胞等的治療效果、分布、靶向 等做出準確的評價，是肝損傷研究領域的重要工具。