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Exosome (外泌體) 1983 年于綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，是活細(xì)胞分泌的直徑約為 30-150nm 的膜性囊泡，包含多種活性分子，如蛋白質(zhì)、脂肪和核酸（mRNA、miRNA及其 它非編碼RNA）等，能作為信號分子傳遞給靶細(xì)胞，從而介導(dǎo)細(xì)胞間的物質(zhì)傳遞與信息交 流。天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等。外泌體 miRNA 通過循環(huán)囊泡 傳遞信息，被認(rèn)為是細(xì)胞間信號交流的第三種途徑。除了 miRNA 外，研究表明外泌體中 的 circRNA、lncRNA和蛋白質(zhì)也參與細(xì)胞內(nèi)的信號調(diào)控。2013年，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞囊泡運輸?shù)恼{(diào) 節(jié)機制的科學(xué)家們，榮獲了當(dāng)年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。作為人體內(nèi)的一類重要囊泡，外泌 體成為科研熱點。

外泌體結(jié)構(gòu)能夠保護活體性物質(zhì)遠距離不被降解，通過配體和細(xì)胞表面受體高效結(jié)合， 進行信息的傳遞。但是外泌體一把劍，既參與正常的生理發(fā)育調(diào)節(jié)過程，又參與病理過 程。改變細(xì)胞外微環(huán)境、提呈抗原、刺激Ｔ細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)機體免疫反應(yīng)及影響機體健康。 如樹突狀細(xì)胞，分泌的外泌體有抗原遞呈的作用，能夠激活T細(xì)胞；曹雪濤院士課題組證 實，腫瘤外泌體RNAs通過激活肺泡上皮TLR3招募中性粒細(xì)胞促進了肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成。

目前對于外泌體的研究，主要集中在外泌體在生理和病理條件下發(fā)揮作用的機制；外泌 體作為液體活檢技術(shù)在癌癥的臨床診斷、預(yù)后判斷中的應(yīng)用；外泌體在疾病治療方面的應(yīng)用 是，從治療劑的包裝到調(diào)控免疫應(yīng)答，應(yīng)用范圍從腫瘤學(xué)到再生醫(yī)學(xué)等。利用小動物活體成 像技術(shù)，可在活體水平長期觀察外泌體的分布、靶向以及判斷外泌體對于疾病的治療。應(yīng)用 上述多種研究領(lǐng)域。

一．功能相關(guān)研究

1．與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)研究

癌癥是由多種細(xì)胞、因子共同作用產(chǎn)生的，它存在于一個復(fù)雜的細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)中，即腫瘤微 環(huán)境。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，微環(huán)境對于轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞的存活與增殖都是必需的。已有研究 表明腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移具有器官特異性，說明特定的器官可能具有更適合腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的環(huán)境。 研究腫瘤的分子環(huán)境有助于找出一些可以阻止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新靶點。越來越多的研究表明 外泌體參與了腫瘤發(fā)生、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程。

曹雪濤院士課題組證實，腫瘤外泌體RNAs通過激活肺泡上皮TLR3招募中性粒細(xì)胞促進 了肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成。這一研究發(fā)現(xiàn)發(fā)布在 Cancer Cell（Cancer Cell 30, 243–256, August 8, 2016）雜志上。研究表明肺上皮細(xì)胞通過TLR3感知腫瘤外泌體RNAs，對于啟動 中性粒細(xì)胞招募及肺轉(zhuǎn)移微環(huán)境形成起至關(guān)重要的作用，為控制癌癥肺轉(zhuǎn)移提供了潛在的靶 點。在自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型中TLR3缺陷小鼠顯示肺轉(zhuǎn)移減少。機制研究證實，原發(fā)腫瘤來源的 外泌體RNAs富含小核RNA（small nuclear RNAs，snRNAs），在肺上皮細(xì)胞中激活TLR3，由 此誘導(dǎo)了肺臟中的趨化因子分泌，促進了中性粒細(xì)胞招募。在研究中使用熒光素酶基因標(biāo)記 LLC 和 B16/F10，通過尾靜脈注射的方式注射 Tlr3/ mice和野生型C57BL/6小鼠，通過IVIS 小動物活體成像系統(tǒng)對肺部進行成像和定量（下圖 B），結(jié)果顯示，Tlr3/ 小鼠肺部的轉(zhuǎn)移 明顯低于野生型小鼠；同時進行肺部切片進行H&E染色，使用Revvity公司組織定量病 理系統(tǒng)進行成像和精確的定量，計算肺部腫瘤的轉(zhuǎn)移負(fù)荷（下圖A）

此外在研究中，還考察了外泌體的分布及外泌體注射后能夠在肺部形成一個促進腫瘤的 轉(zhuǎn)移的微環(huán)境提高腫瘤的轉(zhuǎn)移率。首先在考察外泌體分布時，體外采用鼠Lewis細(xì)胞株（LLC）產(chǎn)生的瘤塊，瘤塊切割成小塊后在武血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)12 hr,隨后收集培養(yǎng)基過濾后通 過超離的方式進行提取，提取的外泌體使用VivoTrack 680進行標(biāo)記，尾靜脈注射后不同時 間點進行成像，結(jié)果顯示外泌體通過尾靜脈注射后會被肺部攝?。ㄏ聢D），其他證據(jù)顯示主 要是被肺泡 II 型上皮細(xì)胞攝取。在 Tlr3-/-和野生型小鼠首先通過外泌體或者對照脂質(zhì)體的 預(yù)處理，兩周后，注射LLC-luc細(xì)胞株，外泌體注射30天時利用IVIS系統(tǒng)進行生物發(fā)光成 像(處理過程如D所示)，檢測腫瘤的轉(zhuǎn)移并且進行定量（下圖J），結(jié)果顯示，預(yù)先注射分離 自腫瘤的外泌體，能夠增加野生型小鼠肺部腫瘤的轉(zhuǎn)移，而Tlr3-/-小鼠則與對照物差異，說 明外泌體能夠產(chǎn)生腫瘤轉(zhuǎn)移的微環(huán)境，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，而這種效應(yīng)是通過肺上皮細(xì)胞Tlr3 介導(dǎo)的。

Cancer Cell,2016 ,30,(2) 8 : 243-256

2.外泌體與免疫相關(guān)研究

復(fù)旦大學(xué)研究人員 Gao Wei 利用 IVIS 成像系統(tǒng)研究了樹突狀細(xì)胞來源的外泌體 （DC-exos）在體內(nèi)的歸巢和功能。成熟樹突狀細(xì)胞通過趨化因子7（CCR7）向次級淋巴器 官的歸巢。據(jù)報道來源于DCs的外泌體會遷移到脾臟誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生。在活體成像實驗中， 首先從成熟和未成熟的樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)液中分離外泌體，使用近紅外染料 DiR 進行染色， 隨后通過尾靜脈注射的方式將20μg外泌體注射入C57BL/6體內(nèi)，使用IVIS進行活體成像(下 圖A)，并且注射4個小時后，將動物解剖，將肝臟和脾臟解剖后進行成像(下圖B)，結(jié)果顯 示注射的外泌體主要集中在動物的上腹部，離體結(jié)果顯示相對與 DC-exos 未成熟成熟的 DC-exos 更多的積累在脾臟。

進一步研究確認(rèn)成熟 DC-exos 在脾臟累積受 CCR7 調(diào)控，mDCs 轉(zhuǎn)染 siRNA CCR7,進行 CCR7的沉默，結(jié)果顯示在CCR7沉默后，成熟DC-exos在脾臟的累積減少。說明了DC-exos 在脾臟累積受CCR7調(diào)控?；铙w中這些脾臟的DC-exos 被脾臟的DCs 和T cells 攝取誘導(dǎo) 炎癥反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)提供了一個新的視野去理解外泌體，外泌體會從親代細(xì)胞中獲取某些特 定的功能。

Scientific Reports , 2017 , 7 :42996

二．外泌體分布研究

Oscar P. B. Wiklander 研究了不同來源的外泌體注射體內(nèi)后其分布規(guī)律。首先探討了 HEK293T 細(xì)胞來源的外泌體（HEK293T-EVs）在 NMRI小鼠體內(nèi)的分布，即使用1.0×1010 p/g 近紅外熒光染料DiR標(biāo)記HEK293T-EVs，通過尾靜脈注射NMRI小鼠體內(nèi)，注射24h后使 用 IVIS 小動物活體成像系統(tǒng)進行成像（圖 A），并且使用 IVIS 系統(tǒng)進行三維光學(xué)成像， Quantum microCT 系統(tǒng)進行結(jié)構(gòu)成像，最后將兩者圖像進行融合(圖B)。從活體數(shù)據(jù)可以看 出HEK293T-EVs主要集中在動物的肝臟。為了確認(rèn)熒光信號確實來自標(biāo)記的HEK293T-EVs， NMRI小鼠尾靜脈注射HEK293T-EVs (1.0×1010 p/g)或者游離OptiMEM-DiR，24h后將PBS未灌注和灌注的HEK293T-EVs注射組臟器及OptiMEM-DiR注射組臟器去除進行定量（圖 C），結(jié)果可以看出，首先Dir已經(jīng)檢測不到信號，而灌注和未灌注組，熒光信號無顯著差異， 說明信號檢測到的信號是來自于器官中HEK293T-EVs的信號，而不是游離染料或者血液中 的信號。為了進一步確定劑量是否影響EVs的分布，NMRI小鼠尾靜脈注射HEK293T-EVs (0.25×1010 p/g、1.0×1010 p/g、1.5×1010 p/g)，24h 將臟器進行解剖進行離體成像,并且計 算各組織熒光信號站總信號的百分比（圖D/E），結(jié)果顯示，不同注射劑量，EVs分布主要 集中在肝臟、脾臟、腸道等部位，但是隨著劑量的增加，整體信號增加，但是肝臟信號的百 分比會降低，提示這一變化可能跟肝臟單核細(xì)胞吸收飽和有關(guān)。

隨后，Oscar P. B. Wiklander 使用 IVIS 系統(tǒng)又考察了不同細(xì)胞來源的EVs在組織分布的 差異，在此選取了一個肌肉細(xì)胞系（C2C12）、黑色素細(xì)胞系（B16F10）和骨髓來源的未成 熟的DCs。結(jié)果顯示DiR標(biāo)記的不同來源的EVs在肝臟、脾臟、腸道和肺都有較高的積累， 但是分布有差別，C2C12-EVs 在肝臟分布較高(71%±1.5)、而 B16F10-EVs分布(56%±2.2) ， DC-derived EVs 分布（46%±0.9)。而肺部的分布則相反， C2C12-EVs 肺部分布僅 (5%±0.5)， B16F10-EVs (13%±1.5) 以及 DC-EVs (10%±0.9)。B16F10-EV 在 GI-tract 分布 相較另兩組更多為15%±3.3，C2C12-EVs (8%±1.3)和DC-EVs (10%±0.8)。有趣的是，DC-EVs 顯示在脾臟累積增加(28%±1.3)而 C2C12-EVs 和 B16F10-EVs 具有相似的分布分別為12%±1.5 和 12%±0.6（圖C/D）,可以推測EVs根據(jù)細(xì)胞的類型具有歸巢的效應(yīng)。

三．治療相關(guān)研究

? 在治療領(lǐng)域，由于外泌體來源細(xì)胞胞漿，含有細(xì)胞成分，所以具備了細(xì)胞的部分功能， 也能代替細(xì)胞完成治療作用。Exovita Biosciences公司，利用外泌體治療癌癥。與免疫治療 的方法不同，Exovita并非要調(diào)動免疫系統(tǒng)，而是調(diào)動正常人體細(xì)胞殺滅癌細(xì)胞。這個新鮮 的技術(shù)正是該公司的獨門絕技。專注于再生醫(yī)學(xué)的BioRegenerative公司，其創(chuàng)始人是加州 大學(xué)圣地亞哥分校的教授，用干細(xì)胞分泌的外泌體生產(chǎn)美容、生發(fā)、干眼病、創(chuàng)傷燒傷的愈 合繃帶、噴霧劑等產(chǎn)品，其效果非常好。

• ? 如晚期非小細(xì)胞肺癌的外泌體臨床試驗所觀察到的，外泌體可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié) 作用，從而潛在地影響疾病進展。 ?

• ? 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的治療作用可能是其外泌體發(fā)揮作用的，因為從MSC 純化的外泌體可以發(fā)揮與MSC治療相似的作用。例，老年性癡呆、腦損傷的 干細(xì)胞治療，因為干細(xì)胞無法穿過血腦屏障，但外泌體能進入大腦發(fā)揮作用。 治療心梗，干細(xì)胞分泌的外泌體治療效果比干細(xì)胞還好。因為干細(xì)胞容易被內(nèi) 臟吸附、攝取或清除，真正到達損傷部位的干細(xì)胞只有5~10%。而100納米的 外泌體體積小，大概只有細(xì)胞的1%，能更順暢地到達靶標(biāo)。

? MSC來源的外泌體已經(jīng)被認(rèn)為是退行性疾病或者損傷的潛在的治療方法，有望成為 細(xì)胞治療的替代品。然而MSC來源的外泌體首微環(huán)境的影響。Zongjin Li 教授利用釋放一氧化氮（NO）的聚合物，增加外泌體促進血管新生的功能。 模型為小鼠的后肢缺血模型，且小鼠血管內(nèi)皮生長因子受體2啟動子下插入luc的 基因 (Vegfr2-luc),因此可以監(jiān)測血管的修復(fù)。使用NO激活的hP-MSCs來源的外泌 體，監(jiān)測外泌體對血管的修復(fù)作用。救過顯示NO處理的，hP-MSCs來源的外泌 體能夠顯著增加血管新生。