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一，什么是重組胰蛋白酶？

重組胰蛋白酶是指利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的胰蛋白酶Trypsin(Parenzyme)，它是絲氨酸蛋白水解酶家族成員之一，屬肽鏈內(nèi)切酶，國際酶學(xué)編號為：EC3.4.4.4。

二，胰蛋白酶的來源及水解特異性

最初發(fā)現(xiàn)并使用的胰蛋白酶是從牛、羊、豬的胰臟提取的，其廣泛存在于在脊椎動(dòng)物和微生物中，不同來源其最適溫度有所不同，其中哺乳動(dòng)物源胰蛋白酶與人體最為相近。

胰臟是胰蛋白酶的前體胰蛋白酶原合成場所，合成后作為胰液的成分而分泌，經(jīng)腸激酶或胰蛋白酶切去前導(dǎo)肽而形成具有活性的胰蛋白酶，為肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷，如果酸性殘基位于裂解位點(diǎn)的任一側(cè)，則水解速率較慢，如果脯氨酸殘基位于裂解位點(diǎn)的羧基側(cè)，則不會(huì)發(fā)生裂解。

胰蛋白酶不僅作為消化酶，同時(shí)還能激活糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起激活作用，是特異性強(qiáng)的蛋白酶。在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它是工具酶。

三，重組胰蛋白酶相對于動(dòng)物提取胰蛋白酶的優(yōu)點(diǎn)

首先，提高了疫苗的安全性，因?yàn)閯?dòng)物提取胰蛋白酶可能含有致病因子、動(dòng)物病毒、朊蛋白等外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)，從而導(dǎo)致在疫苗中的殘留，而重組胰蛋白酶不含這些外來風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)(珠海冀百康的重組胰蛋白酶在生產(chǎn)過程中不使用任何動(dòng)物來源的材料，符合最新發(fā)布的重組胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn))。其次，是產(chǎn)量大幅度提高，降低生產(chǎn)成本、降低分離純化技術(shù)門檻，使之能夠進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)和商品化應(yīng)用(或工業(yè)化應(yīng)用)，且激活后的胰蛋白酶的酶切特異性與動(dòng)物胰腺來源一致。最后，動(dòng)物提取胰蛋白酶由于動(dòng)物來源不同導(dǎo)致批次間差異較大，而重組胰蛋白酶的原材料穩(wěn)定，故產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，批間差異小。

四，胰蛋白酶在疫苗中生產(chǎn)中的應(yīng)用

疫苗是目前預(yù)防疾病發(fā)生和傳播最為有效的方式，主流生產(chǎn)疫苗的主要方法有：雞胚培養(yǎng)系統(tǒng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。

目前使用最為廣泛的是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，動(dòng)物細(xì)胞在適宜環(huán)境下能夠迅速增殖，并且由于其與人體組織細(xì)胞極為相似，故而其生產(chǎn)的疫苗具有很高的免疫原性。傳統(tǒng)的雞胚培養(yǎng)疫苗系統(tǒng)則存在許多不足之處，比如培養(yǎng)的病毒容易發(fā)生變異;與人群流行病毒株存在差異導(dǎo)致疫苗效果不佳或無預(yù)防效果;病毒大范圍傳播時(shí)健康雞胚供應(yīng)受限致使短時(shí)間內(nèi)無法滿足對疫苗的需求。

1. 用于疫苗生產(chǎn)中細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞解離

貼壁依賴型動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)都是貼附于固相表面進(jìn)行生長，一般貼附于培養(yǎng)器皿表面或微載體，我們稱之為貼壁培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后迅速鋪展并以有絲分裂的方式進(jìn)行增殖，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并在形成致密的單層細(xì)胞后停止增殖，隨后進(jìn)行放大傳代培養(yǎng)，此時(shí)就需要使用細(xì)胞消化液對貼壁細(xì)胞進(jìn)行處理，使之成為單個(gè)細(xì)胞并且不對其造成損傷，其中酶類細(xì)胞消化液主要成分為蛋白水解酶和緩沖保護(hù)溶液。當(dāng)前市場上所售以胰蛋白酶消化液為主，胰蛋白酶能夠水解細(xì)胞間的沾粘蛋白，釋放出單個(gè)獨(dú)立細(xì)胞，并且很好的保持細(xì)胞的完整性和細(xì)胞活性。

2. 用于疫苗生產(chǎn)中裂解病毒

以細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)的流感病毒血凝素HA為例：流感病毒血凝素HA被宿主蛋白酶裂解為成熟的HA1和HA2后才能夠介導(dǎo)病毒囊膜與靶細(xì)胞融合，開始病毒生命周期，因此HA的裂解成為病毒感染細(xì)胞的首要因素，因此可以采用外加胰蛋白酶的方式進(jìn)行裂解，以進(jìn)行病毒疫苗的生產(chǎn)，其可有效的提高病毒產(chǎn)量，從而進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)并簡化相關(guān)生產(chǎn)工藝。

3. 用于消除疫苗生產(chǎn)過程中可能造成的生物危害

當(dāng)前基因工程疫苗是國際社會(huì)生物安全管理的一個(gè)集中點(diǎn)，在基因工程疫苗的研制過程中，經(jīng)過基因重組而攜帶外源基因的生物體一旦逃逸到環(huán)境中，經(jīng)過基因整合后，可能會(huì)引起生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，打破其在長期進(jìn)化過程中所形成的生態(tài)平衡，威脅自然界中的生物，有些病毒具有導(dǎo)致靶組織損傷的基因，可能使原本無害的微生物變得極其危險(xiǎn)。

我國對于生物安全相當(dāng)重視，并建立了一整套法律法規(guī)以保障生物安全。胰蛋白酶可用于生產(chǎn)過程中生物危害的消除，病毒粒子主要依靠表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行吸附和侵入宿主細(xì)胞，胰蛋白酶能水解并破壞病毒粒子的衣殼蛋白，并造成病毒粒子脂質(zhì)的丟失，從而讓病毒粒子不再具有吸附和侵入能力，進(jìn)而達(dá)到消除可能形成的危害，達(dá)到防患與未然的目的。

五，逐典重組胰蛋白酶是一款滿足藥典要求的GMP級非動(dòng)物源胰蛋白酶

Trypelectase 重組胰蛋白酶是逐典生物專門為疫苗、病毒載體生產(chǎn)設(shè)計(jì)，具有高效、非動(dòng)物源和高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的特點(diǎn)。該胰蛋白酶氨基酸序列與豬胰腺來源的胰蛋白酶一致，由大腸桿菌(E.col) 重組表達(dá)生產(chǎn)。在GMP級別環(huán)境中生產(chǎn)的重組胰蛋白酶能高效消化貼壁細(xì)胞且不造成傷害，產(chǎn)品質(zhì)量滿足藥典要求。

逐典重組胰蛋白酶特點(diǎn)

1.GMP級生產(chǎn)環(huán)境、符合藥典標(biāo)準(zhǔn)

2.重組生產(chǎn)、不含雜酶

3.批量生產(chǎn)、質(zhì)量穩(wěn)定

4.高純度、高比活

5.非動(dòng)物源原料

逐典重組胰蛋白酶應(yīng)用場景

組織塊的消化解離和原代細(xì)胞的獲取、貼壁細(xì)胞的傳代消化和收獲、微載體方法培養(yǎng)的細(xì)胞消化和收獲。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

CT26.WT 和 HEK293FT 細(xì)胞消化實(shí)驗(yàn)

CT26WT和HEK293FT在經(jīng)Trypelectase重組胰酶消化3min后解離效果較好，細(xì)胞活率顯示對細(xì)胞傷害較小，不會(huì)影響細(xì)胞傳代。

Trypelectase重組豬胰酶對細(xì)胞消化過程及傳代24h細(xì)胞貼壁圖