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內(nèi)毒素檢測在現(xiàn)代生物制品和醫(yī)藥領(lǐng)域中扮演著至關(guān)重要的角色，注射類藥物、注射器具，植入醫(yī)療器械等都有相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，用以確保產(chǎn)品安全性。然而，在進(jìn)行內(nèi)毒素檢測的過程中，許多實(shí)驗(yàn)室和研究人員可能會(huì)面臨一系列挑戰(zhàn)和疑惑。

從選擇合適的內(nèi)毒素檢測試劑盒和試劑耗材，到配備必要的儀器設(shè)備，每個(gè)步驟都需要精心考慮。

Lonza作為內(nèi)毒素檢測領(lǐng)域的專家，今天小編邀請(qǐng)到了技術(shù)大佬加菲哥，為大家?guī)?span style="font-synthesis: style; font-weight: 600;">內(nèi)毒素檢測問答系列，本系列文章旨在解答您在內(nèi)毒素檢測中可能遇到的常見問題，提供實(shí)用建議，幫助您更好地理解并成功應(yīng)對(duì)內(nèi)毒素檢測過程中的關(guān)鍵問題。

無論您是初次接觸內(nèi)毒素檢測還是希望深入了解此領(lǐng)域的專業(yè)人士，本系列文章將為您提供龍沙有關(guān)內(nèi)毒素檢測方面的見解和實(shí)用的建議。

文末webinar報(bào)名切勿錯(cuò)過

1. 如何選擇內(nèi)毒素檢測試劑盒？

檢測測方法的選擇：如果做范圍定性檢測，可以使用凝膠法試劑盒（如PYROGENT™）。但如果需要定量檢測，凝膠法試劑盒可能就不適合，因?yàn)槟z法檢測一般只能給出小于或大于的結(jié)果，其通過對(duì)樣品進(jìn)行多次稀釋，將樣品的EU/ml結(jié)果縮小到一個(gè)范圍，一般是當(dāng)作半定量的方法。

如需要選擇定量檢測進(jìn)行內(nèi)毒素檢測比較適合的是濁度法試劑盒（如PYROGENT™-5000），顯色法試劑盒（如Kinetic-QCL™）和重組C因子方法試劑盒（如PyroGene™）。

▲ PYROGENT™-5000動(dòng)態(tài)濁度LAL試劑盒

▲ Kinetic-QCL™ 動(dòng)態(tài)顯色法LAL試劑盒

另外，在樣品放行限度和樣品稀釋需求進(jìn)行檢測靈敏度考量方面：

· PYROGENT™凝膠法試劑盒靈敏度為0.03、0.06、0.125 和 0.25 EU/mL

· 動(dòng)態(tài)濁度法PYROGENT™-5000試劑盒靈敏度為0.01EU/mL

· 動(dòng)態(tài)顯色法Kinetic-QCL™靈敏度為0.005EU/mL

· 重組C因子方法檢測靈敏度為0.005EU/mL。

2. 內(nèi)毒素檢測需要哪些儀器設(shè)備？

不同內(nèi)毒素檢測方法需要使用不同配置的設(shè)備。

使用PYROGENT™ 凝膠法，則需要37°C 恒溫加熱儀。

使用動(dòng)態(tài)顯色法Kinetic-QCL™或動(dòng)態(tài)濁度法試劑盒PYROGENT-5000™，則需要光吸收酶標(biāo)儀和相應(yīng)軟件。酶標(biāo)儀還應(yīng)具有振蕩和37°C恒溫孵育功能，動(dòng)態(tài)顯色法Kinetic-QCL™需要配置405nm光吸收檢測通道，PYROGENT-5000™試劑盒需要340nm光吸收檢測通道。Lonza Elx808™、Nebula™ MMR、Nebula™ AR均能滿足以上性能要求。

▲ Nebula™吸光度酶標(biāo)儀

使用PyroGene™ 重組C因子試劑盒，則需要380nm（激發(fā)波長）/440 nm（發(fā)射波長）濾光片組合熒光酶標(biāo)儀，Lonza PyroWave™ XM、Nebula™ MMR均能滿足以上性能要求。

▲ PyroGene™ 重組因子C試劑盒

所有的內(nèi)毒素檢測試劑盒的使用都需要使用渦旋混勻儀和移液器，以及計(jì)時(shí)器。

此外，推薦搭配內(nèi)毒素檢測專用軟件WinKQCL™ ，用于內(nèi)毒素定量檢測。該軟件除了具有常規(guī)的數(shù)據(jù)采集、權(quán)限管理、審計(jì)追蹤、數(shù)據(jù)完整性、數(shù)字簽名、數(shù)據(jù)分析、報(bào)告生成和導(dǎo)出、LIMS/MES等系統(tǒng)對(duì)接功能和數(shù)據(jù)備份功能外，還有您所期望的趨勢(shì)分析、數(shù)據(jù)安全性和“smart stop"（智能停止）功能，以及審計(jì)追蹤條目篩選、一個(gè)板子同時(shí)運(yùn)行多個(gè)實(shí)驗(yàn)并獨(dú)立生成報(bào)告的功能。

3. 如何查詢內(nèi)毒素檢測試劑盒的CoA和SDS文件？

所有內(nèi)毒素檢測產(chǎn)品都可以在Lonza Bioscience | Lonza輸入試劑盒貨號(hào)和批號(hào)進(jìn)行CoA查詢和SDS下載。

4. 為什么建議使用玻璃器皿不建議使用塑料器皿？

塑料表面比玻璃表面對(duì)內(nèi)毒素的吸附力更強(qiáng)。因此，建議制備內(nèi)毒素對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)(CSE)稀釋液時(shí)使用硼硅酸鹽玻璃稀釋管。某些情況下，某些塑料器皿也可以用于內(nèi)毒素檢測。

總之，玻璃是材料，PE（聚乙烯）次之，PP（聚丙烯）再次之，也有客戶反饋還可以使用PET材質(zhì)器皿。如果需要對(duì)樣品進(jìn)行保存，建議對(duì)不同材質(zhì)容器的進(jìn)行相應(yīng)驗(yàn)證，保證樣品中內(nèi)毒素在儲(chǔ)存后是否可以回收的。

5. 為什么CSE稀釋液配置渦旋過程很重要？

內(nèi)毒素會(huì)粘附在玻璃表面上，可以通過適當(dāng)?shù)臏u旋來充分溶解和混勻，以保證反應(yīng)管或微孔板中的溶液具有準(zhǔn)確的EU/ml濃度。如說明書所述，稀釋之前，CSE小瓶應(yīng)劇烈渦旋15分鐘，每次使用CSE時(shí)都應(yīng)重復(fù)此操作。標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋液配制時(shí)，建議至少渦旋一分鐘。標(biāo)準(zhǔn)品使用前也建議渦旋CSE稀釋液幾秒鐘以確保均勻度和準(zhǔn)確性。

6. 為什么要使用匹配的試劑？

首先，是合規(guī)性要求。

其次， Lonza的每個(gè)LAL鱟試劑批次都使用美國藥典內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品(RSE)EC-6（效價(jià)為10000EU/瓶）進(jìn)行效價(jià)測試。然后通過與RSE平行測試，將該LAL鱟試劑批次與我們的工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)相匹配。該RSE/CSE相關(guān)測定確定了該批次CSE與該批次LAL鱟試劑一起使用時(shí)的效力，因此需要匹配使用。

FDA表示，使用LAL鱟試劑制造商的質(zhì)量證書使公司不必自己進(jìn)行RSE/CSE比較。Lonza提供所有檢測方法的試劑盒，并且有匹配的試劑，使內(nèi)毒素檢測更簡單。

7. 如何確定工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)的效價(jià)？

Lonza用于測定CSE效價(jià)的方法可在每個(gè)匹配試劑盒的CoA中找到。

常見方法為：多支CSE稀釋后被當(dāng)作未知樣品，通過RSE稀釋梯度來進(jìn)行檢測和計(jì)算，單位為EU/ml。對(duì)于定量檢測方法，檢測結(jié)果在RSE標(biāo)曲范圍內(nèi)的多支CSE檢測值進(jìn)行平均即可得到效價(jià)。

8. 應(yīng)該如何配制LAL試劑？

請(qǐng)溫柔對(duì)待Lonza LAL鱟試劑。復(fù)溶后通過輕輕倒置或旋轉(zhuǎn)小瓶，瓶內(nèi)試劑會(huì)很容易溶解，渦旋或劇烈搖晃復(fù)溶后的LAL試劑會(huì)產(chǎn)生氣泡。

使用前幾分鐘重新配制即可，加入LAL鱟試劑后，切勿渦旋。

9. 應(yīng)該如何準(zhǔn)備樣品進(jìn)行測試？

測試前，需要根據(jù)樣品實(shí)際情況進(jìn)行樣本前處理。大多數(shù)樣品只需要稀釋，使用內(nèi)毒素檢測試劑盒進(jìn)行測試即可。

可以通過樣品的MVD（最大有效稀釋倍數(shù)）確定樣品的可稀釋倍數(shù)。樣品MVD=內(nèi)毒素限值(EU/ml)/λ（λ為標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度值，對(duì)于凝膠凝塊，λ為鱟試劑的標(biāo)記靈敏度）。樣品稀釋倍數(shù)不能超過MVD，為了保證足夠的安全范圍，建議稀釋倍數(shù)盡量不要超過1/2MVD。

如果樣品有蛋白酶干擾并導(dǎo)致假陽性結(jié)果，建議對(duì)樣品稀釋并70°C加熱5-15分鐘進(jìn)行熱滅活處理。如需要，可以對(duì)滅活樣品進(jìn)行進(jìn)一步稀釋后檢測。

如果樣品可能含有受β-葡聚糖，建議使用β-葡聚糖阻斷劑(b-G-BlockerTM)。β-葡聚糖可能來自酵母和纖維素材料。鱟試劑測試中可以看到β-葡聚糖常見的稀釋/反應(yīng)模式：濃縮樣品的陰性響應(yīng)、稀釋度增加時(shí)陽性響應(yīng)，最高稀釋度時(shí)陰性響應(yīng)。使用動(dòng)態(tài)檢測法，β-葡聚糖污染的樣品中經(jīng)常出現(xiàn)協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)。

如果樣品中因含有內(nèi)毒素結(jié)合物而存在抑制，可以嘗試使用分散劑PYROSPERSE™。比如脂質(zhì)乳化劑，電解質(zhì)溶液，血清和血漿蛋白樣品也可以使用PYROSPERSE™。

10. 樣品合適的pH值是多少？如何調(diào)節(jié)pH?

內(nèi)毒素檢測是一系列的酶促反應(yīng)過程，最適反應(yīng)pH值范圍為6-8，因此樣品建議pH為6-8。如果樣品pH值超出此范圍，可以使用緩沖液如Tris Buffer、HCl或NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié)。

為確保緩沖液不含內(nèi)毒素，需要在使用前進(jìn)行檢測，或者選擇商業(yè)化試劑，如Lonza的50 mM Tris Buffer。

11. 如冰箱的溫度超出了預(yù)設(shè)范圍，試劑還可以使用嗎？

這個(gè)問題經(jīng)常被問到，請(qǐng)盡量進(jìn)行冰箱溫度監(jiān)測，保證溫度正常。

內(nèi)毒素檢測試劑產(chǎn)品的正常儲(chǔ)存溫度為2-8°C。如果試劑沒有復(fù)溶的情況下，短時(shí)間內(nèi)的失溫對(duì)試劑影響不大，凍干組分很穩(wěn)定。如果遇到該情況，建議對(duì)試劑盒進(jìn)行初始質(zhì)量測試，以確認(rèn)該試劑盒性能狀態(tài)。