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螢光素酶與螢光素底物反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象多應(yīng)用于生物發(fā)光成像。利用螢光素酶基因標(biāo)記細(xì)胞，注射螢光素底物后檢測(cè)螢光強(qiáng)度，可實(shí)時(shí)監(jiān) 測(cè)目的細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況與藥物使用效果。由于螢光反應(yīng)中還涉及ATP，因而也可利用ATP對(duì)體系的影響指示能量或生命狀態(tài)。
一，D-螢光素鉀鹽的原理
螢光素酶在ATP、Mg2+和O2的條件下催化D-螢光素鉀鹽進(jìn)行氧化脫羧反應(yīng)，發(fā)出平均波長(zhǎng)為560nm的藍(lán)綠色熒光。當(dāng)螢光素鉀鹽過
量時(shí)，產(chǎn)生的光量子數(shù)與螢光素酶的濃度呈正相關(guān)性。由于其方便檢測(cè)、定量準(zhǔn)確、在生物技術(shù)領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用，特別是體內(nèi)活體成
像領(lǐng)域和報(bào)告基因技術(shù)領(lǐng)域。
二，D-螢光素鉀鹽的使用方法
1. 溶液的制備
D-熒光素鉀鹽的溶液可以用于染色、標(biāo)記、檢測(cè)等多種應(yīng)用。
制備D-熒光素鉀鹽溶液的方法：
a.首先稱取適量的D-熒光素鉀鹽，加入適量的去離子水中后進(jìn)行均勻攪拌；
b.使用過濾膜將溶液過濾，除菌。
c.將D-熒光素鉀鹽溶液調(diào)節(jié)至所需要的濃度。
2. 染色實(shí)驗(yàn)過程
D-熒光素鉀鹽可以用于細(xì)胞染色、組織染色等染色實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
a.首先將細(xì)胞或組織樣本固定在載玻片上。
b.然后加入適量的D-熒光素鉀鹽溶液，使試劑溶液可以覆蓋樣本。
c.在黑暗條件下可以孵育一段時(shí)間，使D-熒光素鉀鹽充分滲透入細(xì)胞或組織中。
d.使用PBS緩沖液洗滌樣本，去除多余的D-熒光素鉀鹽。
e.在顯微鏡下觀察樣本，觀察樣品的熒光信號(hào)。
3. 實(shí)驗(yàn)標(biāo)記
D-熒光素鉀鹽也可以用于標(biāo)記蛋白質(zhì)、核酸等生物分子。
實(shí)驗(yàn)標(biāo)記方法：
a.首先將蛋白質(zhì)或核酸與d-熒光素鉀鹽共同孵育。
b.再用凝膠電泳等方法分離標(biāo)記后的生物分子。
c.最后在熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記后的生物分子即可。
4. 檢測(cè)方法
D-熒光素鉀鹽可用于檢測(cè)生物分子的存在和濃度。
D-熒光素鉀鹽檢測(cè)方法：
a.將d-熒光素鉀鹽與待檢測(cè)的生物分子進(jìn)行共同孵育。
b.用凝膠電泳等方法分離孵育后的混合物。
c.在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)，即可判斷生物分子的存在和濃度。
三，逐典D-螢光素鉀鹽優(yōu)勢(shì)
1.高純度（HPLC驗(yàn)證純度≥99%)
2.優(yōu)異的生物發(fā)光性能
3.高溶解度（>40mg/ml)
四，應(yīng)用場(chǎng)景
D-熒光素鉀鹽在不同領(lǐng)域具有多種應(yīng)用場(chǎng)景。其中包括蛋白表達(dá)研究、抗腫瘤或抗病物研究以及mRNA疫苗開發(fā)等。
蛋白表達(dá)研究：將Luc基因插入需要研究的蛋白中，可用于定量目標(biāo)蛋白在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)情況。
抗腫瘤或抗病物：在腫瘤細(xì)胞或病毒中導(dǎo)入Luc基因，建立腫瘤或病毒感染小鼠模型，注射藥物后，通過活體成像技術(shù)觀測(cè)腫瘤大小或病毒感染的變化。
mRNA疫苗開發(fā)：在mRNA中插入Luc基因，脂質(zhì)體包裹后注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，可通過活體成像技術(shù)可觀測(cè)疫苗的免疫效果。
五，應(yīng)用案例分享
六，常見問題答疑
Q:D-螢光素鉀鹽的純度是多少？純度大小對(duì)實(shí)驗(yàn)有影響嗎？
A:D-螢光素鉀鹽純度≥99 %，螢光素純度越高，相應(yīng)污染物含量越低，相反則越高，污染物濃度過高將抑制某些酶和細(xì)胞中的生物學(xué)過程，可能會(huì)給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)偏差，并且可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成傷害。
Q:D-螢光素鉀鹽溶解度是多少？其溶液穩(wěn)定嗎？
A:D-螢光素鉀鹽溶解度在40 mg/ml以上，其水溶液短期內(nèi)存放于-80℃，對(duì)實(shí)驗(yàn)效果沒有明顯影響。對(duì)于部分條件較敏感的實(shí)驗(yàn)，為了控制實(shí)驗(yàn)中的可變因素，推薦反應(yīng)液新鮮配制。例如，熒光素酶過低、非最適的反應(yīng)條件等都需要高質(zhì)量的底物才能進(jìn)行反應(yīng)。
Q:D-螢光素鉀鹽的建議用量是多少？
A:活體成像：以10 μL/g體重確定注射量。每只小鼠接受150 mg D-螢光素鉀鹽/kg體重（如對(duì)于體重為10 g的小鼠，需要注射100 μL以提供1.5 mg D-螢光素鉀鹽）。
體外成像：一般使用150μg/ml的工作液用于體外細(xì)胞成像。
Tips: 注射方式、動(dòng)物類型以及體重等都會(huì)影響信號(hào)的發(fā)射，需要適當(dāng)摸索，待螢光信號(hào)達(dá)到穩(wěn)定平臺(tái)期，再用相應(yīng)儀器進(jìn)行成像分析。
Q:配置好的D-螢光素鉀鹽溶液如何儲(chǔ)存？
A:工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，理想情況下，配置好的儲(chǔ)存液可于-20℃儲(chǔ)存較短時(shí)間。如有必要，螢光素溶液可在-20℃儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)3周。
Tips: 上述溶液在任何一種溫度長(zhǎng)時(shí)間貯存下都有可能導(dǎo)致信號(hào)退化哦！
Q:螢光素（酶）底物的形式有哪些？
A:分為D-螢光素游離酸、D-螢光素鉀鹽和D-螢光素鈉鹽，由于水溶性高，因此鉀鹽和鈉鹽通常是通用的兩種檢測(cè)底物，其中又以鉀鹽作為活體動(dòng)物檢測(cè)使用的主要形式。
Q:如何確定不同模型的峰值信號(hào)時(shí)間?
A:生物發(fā)光信號(hào)的動(dòng)力學(xué)具有組織依賴性。建議每5-10min對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次成像，最多40 min，為每個(gè)新模型創(chuàng)建一個(gè)動(dòng)力學(xué)曲線。(常見信號(hào)峰值時(shí)間點(diǎn)在10-15 min左右，螢光反應(yīng)發(fā)光一般在30 min后衰減，3 h后消失。)具體詳見逐典D-螢光素鉀鹽說明書“螢光素動(dòng)力學(xué)曲線制備"。
Q:螢光素底物可以透過血腦屏障嗎？
A:螢光素底物約280 Da，螢光素的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細(xì)胞膜和血腦屏障。
Q:螢光素酶的表達(dá)穩(wěn)定性如何？
A:螢光素酶基因能夠通過穩(wěn)定篩選等過程插到細(xì)胞染色體內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂、轉(zhuǎn)移、分化從而進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)，螢光素酶的半衰期約為3 h，故只有活細(xì)胞才能持續(xù)表達(dá)螢光素酶。
