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自體T細(xì)胞免疫療法的研究和開發(fā)進(jìn)展迅速，但關(guān)鍵瓶頸在于擴(kuò)大制造規(guī)模以滿足商業(yè)需求。其中一個(gè)關(guān)鍵痛點(diǎn)是GMP病毒載體（慢病毒和γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒）的安全性、漫長(zhǎng)的生產(chǎn)周期和高額的費(fèi)用。解決這個(gè)問(wèn)題的一個(gè)辦法是利用非病毒轉(zhuǎn)染方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因修飾。
Lonza的4D-Nucleofector™LV 單元采用電穿孔技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、可擴(kuò)展多種細(xì)胞類型和應(yīng)用的非病毒轉(zhuǎn)染方案。
Cocoon®平臺(tái)是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模自動(dòng)化生產(chǎn)的新工具，它可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離、激活、轉(zhuǎn)導(dǎo)、擴(kuò)增、細(xì)胞清洗和收獲，同時(shí)提供整個(gè)過(guò)程中的實(shí)時(shí)生物反饋（溫度、CO2、pH和DO）。
通過(guò)將Cocoon®平臺(tái)和4D-Nucleofector™LV 單元聯(lián)合起來(lái)，可以實(shí)現(xiàn)非病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、全封閉、自動(dòng)化的工作流程。
Lonza提供了一個(gè)可以降低成本、提高流程效率、提高終產(chǎn)品質(zhì)量的聯(lián)合平臺(tái)。以下實(shí)驗(yàn)的目的是證明Lonza聯(lián)合平臺(tái)的T細(xì)胞基因編輯和生產(chǎn)的可行性。
關(guān)鍵流程步驟
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圖1：工作流程圖
以新鮮/冷凍的PBMC作為起始，4D-Nucleofector ™轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)入Cocoon®平臺(tái)，第10天收獲最終的T細(xì)胞產(chǎn)物。
如圖1所示，在電轉(zhuǎn)后
第0天-完成電轉(zhuǎn)的PBMC在Cocoon® cassette中靜置4小時(shí)恢復(fù)，用含有IL-2和TransAct的X-VIVO培養(yǎng)基進(jìn)行80%換液。
第1天–進(jìn)行50%的培養(yǎng)基交換（276ml容量）。
第3天–進(jìn)行80%的培養(yǎng)基交換（450ml容量），并移除TransAct。
第4天到第9天-進(jìn)行75%的培養(yǎng)基交換（450ml容量）。
第10天-收集擴(kuò)增的T細(xì)胞。
在第0、1、4、7和10天取樣分析。
結(jié)果分析*
圖2 A-C：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的GFP表達(dá)隨著時(shí)間的推移而下降
A:%GFP+CD3+T細(xì)胞群；B:%GFP+CD4+T細(xì)胞群；C:%GFP+CD8+T細(xì)胞群。
（凍存樣品n=2 來(lái)自1個(gè)donor；新鮮樣品n=3來(lái)自2個(gè)donor）
圖3：細(xì)胞擴(kuò)增曲線圖
圖4 A-B：第1天與第10天的CD4+:CD8+比率
A：第1天的CD4+:CD8+比例；B: 第10天CD4+:CD8+比例。
表1：驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)與終產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性
轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞產(chǎn)量、細(xì)胞活力和%CD3+細(xì)胞純度符合驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。
結(jié)論
這些研究結(jié)果說(shuō)明了Cocoon®平臺(tái)聯(lián)合4D-Nucleofector™LV 單元實(shí)現(xiàn)非病毒細(xì)胞治療生產(chǎn)過(guò)程自動(dòng)化的實(shí)用性。
通過(guò)在激活和擴(kuò)增前轉(zhuǎn)染PBMC，此聯(lián)合平臺(tái)生產(chǎn)了滿足臨床相關(guān)要求（高細(xì)胞產(chǎn)量、轉(zhuǎn)染效率和純度）的基因修飾T細(xì)胞產(chǎn)物。
Cocoon®平臺(tái)和4D-Nucleofector™LV 單元提供了一種替代性的非病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)體系。
該集成平臺(tái)提供轉(zhuǎn)染和操作可擴(kuò)展性、高細(xì)胞產(chǎn)量、減少成本、減少操作員錯(cuò)誤以及更好的過(guò)程控制，以提供高質(zhì)量的細(xì)胞免疫療法。
