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Avidin-TRITC/羅丹明標記親和素

幾乎所有用于標記的物質(zhì)均可以同親和素（AV）或鏈霉親合素（SA）結(jié)合。小分子的有１２５I、膠體金、熒光素和化學(xué)發(fā)光物，大分子物質(zhì)有酶、抗原或抗體、鐵蛋白和熒光蛋白等，其中最常用的是酶、異硫氰酸熒光素（FITC）和膠體金． 親和素或鏈霉親和素均為大分子蛋白，其與酶的標記結(jié)合物的制備除可用普通酶標記蛋質(zhì)分子的直接標記法外．由于其*的與生物素結(jié)合的性能，還可以通過與生物素化酶復(fù)合物中的生物素結(jié)合，間接地與酶形成結(jié)合物。

以下舉例介紹幾種制備親和素（或鏈霉親和素）與常用酶形成標記結(jié)合物的方法。
 
（一）親和素的標記
  1.HRP-親和素結(jié)合物的制備
   （1）改良過碘酸鈉法：新配制的HRP溶液中加入過碘酸鈉（NaIO4），將酶分子上的糖基氧化成醛基；依次用醋酸鹽溶液（pH4.5—5）和碳酸鹽緩沖液（pH9.0）透析，然后在HRP醛基溶液中滴加親和素攪拌反應(yīng)，HRP的醛基即可與親和素的氨基共價結(jié)合；加入（NaBH4）終止反應(yīng)，再透析、離心去沉淀，上清液即含HRP-AV結(jié)合物：
   （2）戊二醛法：用新配制的HRP與親和素溶液充分混勻，加雙功能交聯(lián)劑戊二醛室溫反應(yīng)，后者的二個醛基分別與HRP和親和素分子中的氨基形成Schiff&＃39;s，堿使二者連接，經(jīng)充分透析去掉未反應(yīng)戊二醛，再離心去沉淀等雜質(zhì)，收集上清液（含HRP-AV結(jié)合物）。

  2.親和素-生物素化HRP復(fù)合物的制備：

  利用親和素與生物素間特異的結(jié)合，將親和京素與等體積的生物素化酶（HRP－B）按一定濃度比例混合反應(yīng)后，親和素即與HRP-B中的生物素結(jié)合，形成親和素—生物素化HRP復(fù)合物（avidin-biotin-peroxidase complex，ABC）。
      制備ABC復(fù)合物時應(yīng)注意，親和素和HRP-B的濃度應(yīng)控制不高于40μg／ml和10μg／ml，否則將增加非特異反應(yīng)。

  3.親和素-生物素化堿性磷酸酶（avidin－biotinylated—alkaline phosphatase，ABAP）復(fù)合物的制備:將親和素溶液與生物素化AP按4:l（濃度比）比例混合反應(yīng)（至少十分鐘）后即可制得ABAP復(fù)合物。

（二）鏈霉親和素的標記
  鏈霉親和索（SA）因表面所帶正電荷少，且不含糖基，在實驗中的非特異性結(jié)合遠低于親和素，因此目前以鏈霉親和素標記的酶結(jié)合物更為常用。
１.HRP-SA結(jié)合物的制備　

采用過碘酸鈉直接標記：反應(yīng)在４℃進行，先在ＨＲＰ中加入NaIO4，然后直接加鏈霉親和素溶液混勻，再用碳酸鹽緩沖液（ＰＨ９．０）透析后，用KBH4終止反應(yīng)：加飽和硫酸銨沉淀，離心后棄上清液，再用PBS復(fù)溶沉淀即得HRP-SA結(jié)合物．     

２.SA－生物素化HRP復(fù)合物的制備　

按BNHS標記抗體法制備生物素化HRP（ HRP-Ｂ），再將HRP-Ｂ適當稀釋后，加入等體積的鏈霉親和素溶液（HRP-Ｂ與SA濃度比約１：４）反應(yīng)，即可制得SA－生物素化酶復(fù)合物（streptavidin-biotin-peroxidaes complex，SABC）.
3.ＡP-SA結(jié)合物的制備　

采用戊二醛二步法：先用飽和硫酸銨沉淀堿性磷酸酶，離心后加過量戊二醛溶液復(fù)溶堿性磷酸酶沉詫．戊二醛的一個醛基即與堿性磷酸醇的氨基結(jié)合：充分透析除去未結(jié)合戊二醛后，加鏈霉親和素與結(jié)合了堿性磷酸酶的戊二醛另一個醛基結(jié)合，用賴氨酸終止反應(yīng)，離心后留取含AP-SA結(jié)合物上清液備用。

Avidin-TRITC/羅丹明標記親和素
 

Streptavidin-CY5

Streptavidin-CY3

Streptavidin-TRITC

Streptavidin-FITC

Streptavidin-thiol

Avidin-CY3

Avidin-CY5

Avidin-CY5.5

Avidin (without modification)  

Avidin-Sepharose

Avidin-thiol

Avidin-FITC

Avidin-TRITC

HAS- Sepharose beads

HSA-SH

HSA-Biotin

HSA-TRITC

HSA-FITC

HSA-CY5

HSA-CY3

HSA-CY5.5

HSA, without modification

 

BSA-Sepharose beads

BSA-SH

BSA-Biotin

BSA-TRITC

BSA-FITC

BSA-CY5

BSA-CY3

BSA-CY5.5

BSA, without modification

BSA-tetramethylrhodamine

Concanavalin A刀豆求蛋白A產(chǎn)品：

Concanavalin A-CY5

Concanavalin A-CY3

Concanavalin A-CY5.5

 

Concanavalin A-Sepharose

Concanavalin A-Biotin

Concanavalin A-SH

Concanavalin A-tetramethylrhodamine

Concanavalin A-FITC

Concanavalin A (without modification)

Protein A (recombinant)產(chǎn)品：

Recombinant Protein A-CY5

Recombinant Protein A-CY3

Recombinant Protein A-CY5.5

Recombinant Protein A-peroxidase (HRP)

Recombinant Protein A-Agarose Beads

Recombinant Protein A-Biotin

Recombinant Protein A-thiol

Recombinant Protein A-tetramethylrhodamine  

Recombinant Protein A-FITC

Recombinant Protein A (without modification)