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CdSe/ZnS量子點(diǎn)在納米藥物研究中的應(yīng)用

量子點(diǎn)諸多光學(xué)優(yōu)點(diǎn)使其廣泛應(yīng)用于細(xì)胞標(biāo)記、組織成像、腫瘤識(shí)別等生命科學(xué)領(lǐng)域。量子點(diǎn)在生物標(biāo)記中取得的成功促使藥物研發(fā)人員將其應(yīng)用于納米藥物的熒光成像研究。由于納米藥物粒度尺寸小，組成材料和結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其藥效評(píng)價(jià)方法 和分析技術(shù)手段必將與其原形藥物存在明顯差異。以體內(nèi)藥物分析中經(jīng)典的色譜分析技術(shù)進(jìn)行納米藥物靶向效率、藥效評(píng)價(jià)以及體內(nèi)行為研究，不僅操作繁瑣，耗資巨大，而且效率較低。熒光成像技術(shù)的發(fā)展為藥物活體研究提供了新的技術(shù)平臺(tái)和發(fā)展機(jī)遇。目前人們可以應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡和近紅外成像系統(tǒng)分別實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和活體水平的熒光信號(hào)檢測(cè)。而量子點(diǎn)具有熒光效率高、抗光漂白能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，將其與熒光成像的方法相結(jié)合，則能夠?qū)崟r(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)納米藥物在活體細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)的行為，并且響應(yīng)速度快，便于長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)觀察。熒光量子點(diǎn)的應(yīng)用有助于直觀、快速、準(zhǔn)確地獲取納米藥物在生物體內(nèi)分布、轉(zhuǎn)運(yùn)、釋放和藥效機(jī)理等重要信息，為設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)臨床用納米藥物提供技術(shù)支持。


1、       量子點(diǎn)納米藥物載體


   量子點(diǎn)的表面修飾技術(shù)已經(jīng)比較成熟，表面配體為巰基乙酸、 巰基乙胺或聚乙二醇（PEG）等聚合物的水溶性量子點(diǎn)能夠以靜電結(jié)合或共價(jià)結(jié)合的方式和藥物分子偶聯(lián)，形成以量子點(diǎn)為載體的納米藥物復(fù)合物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥物分子在細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)的熒光示蹤研究。


   量子點(diǎn)標(biāo)記抗高血壓藥物卡托普利（Cap），分析其在小鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)和代謝過(guò)程。他們利用Cap分子中巰基和量子點(diǎn)的強(qiáng)配位作用，將脂溶性量子點(diǎn)表面的TOPO配體置換，形成QDs-Cap復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)合物也表現(xiàn)出和Cap 類(lèi)似的降壓作用。活體成像的熒光信號(hào)顯示復(fù)合物終主要在肝臟、肺和脾臟蓄積。盡管起藥效的是復(fù)合物還是Cap分子等問(wèn)題尚需進(jìn)一步驗(yàn)證，但這一工作為小分子藥物的體內(nèi)研究提供了新的思路。通過(guò)活體熒光成像的方法評(píng)價(jià)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）的腫瘤靶向特性和體內(nèi)動(dòng)力學(xué)。將近紅外量子點(diǎn)和EGF共價(jià)相連，形成EGF-QDs納米熒光探針。小鼠尾靜注給藥后，活體近紅外熒光成像顯示EGF-QDs具有 腫瘤內(nèi)流（約3 min）、清除（約60 min）和蓄積（1-6h）三個(gè)特定時(shí)相，24 h后腫瘤 熒光下降至基線水平。離體臟器的近紅外熒光和腫瘤組織切片共聚焦顯微鏡分析也證實(shí) 其腫瘤特異性蓄積特性。


   RNA干擾技術(shù)可以通過(guò)沉默基因來(lái)阻礙特定蛋白的合成，從而達(dá)到疾病治療的效果。以量子點(diǎn)作為納米載體，將腫瘤靶向F3多肽和siRNA分子同時(shí)標(biāo)記在量子點(diǎn)表面，實(shí)現(xiàn)了siRNA的腫瘤細(xì)胞靶向運(yùn)送和熒光示蹤。量子點(diǎn)作為siRNA載體，除起到熒光示蹤作用外，藥物療效也得到明顯的改善。他們?cè)诹孔狱c(diǎn)表面修飾帶有叔胺結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，形成帶正電的“質(zhì)子海綿”，從而可以和siRNA通過(guò) 靜電作用結(jié)合。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)熒光信號(hào)跟蹤復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞膜、內(nèi)涵體中解離、釋放到細(xì)胞質(zhì)等復(fù)雜步驟。研究證實(shí)，應(yīng)用該技術(shù)向MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入siRNA的效率是現(xiàn)有常規(guī)方法的10至20倍，而毒性則下降了5至6倍。


2、       納米藥物載體的量子點(diǎn)標(biāo)記


新型納米藥物載體的研發(fā)是納米藥物研究的一個(gè)重要組成部分。由于這類(lèi)開(kāi)發(fā)是針對(duì)藥理和藥效基本明確的藥物，通過(guò)載體或劑型的改進(jìn)達(dá)到提高療效的目的，因此風(fēng)險(xiǎn)小、見(jiàn)效快，是目前納米藥物研究領(lǐng)域?yàn)榛钴S的一個(gè)方向。在生物標(biāo)記的研究中，為了提高量子點(diǎn)的標(biāo)記靶向性和生物相容性，科研人員選擇多種生物材料作為包覆物制備成包裹量子點(diǎn)的脂質(zhì)體、乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米球、聚 D,L-乳酸（PLA）納米球等（見(jiàn)表），為納米藥物載體的量子點(diǎn)標(biāo)記方法研究奠定了基礎(chǔ)。

⑴ 脂質(zhì)體


用表面為 TOPO 的脂溶性 CdSe/ZnS 量子點(diǎn)標(biāo)記了兩性離子甘油-3-磷脂酰膽堿（DOPC）和陽(yáng)離子1,2-二油酰-3-*銨基丙烷（DOTAP）小單層脂質(zhì)體（圖A）。低溫透射電鏡（cryo-TEM）顯示量子點(diǎn)通過(guò)疏水作用自組裝嵌入到脂質(zhì)體磷脂雙層膜內(nèi)。通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察到兩種脂質(zhì)體可以結(jié)合在人肺上皮細(xì)胞表面并被其內(nèi)吞。進(jìn)一步將脂質(zhì)體注射到活體種植的人宮頸 T 癌T 腫瘤內(nèi)，組織切片熒光表明陽(yáng)離子 DOTAP 脂質(zhì)體 T 的腫瘤攝取和保留明顯強(qiáng)于 TDOPC 脂質(zhì)體。另外一個(gè)工作以相似的手 段考察了不同磷脂組成脂質(zhì)體的細(xì)胞靶向性差異。 分別制備了磷脂膜量子點(diǎn)熒光標(biāo)記的TDOTAP∶二豆冠酰磷脂酰 T 膽堿（TDMPC）（25∶75）和 DOTAP∶二棕櫚酸磷脂酰乙醇胺（DPPE）-PEG2000∶DMPC（25∶0.5∶74.5）的陽(yáng)離子小單層脂質(zhì)體，進(jìn)行 HEK293 細(xì)胞標(biāo)記研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)種脂質(zhì)體幾秒鐘就被細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而第二種則選擇 性的標(biāo)記細(xì)胞膜，共培養(yǎng) 1 h 后細(xì)胞質(zhì)中也沒(méi)有檢測(cè)出熒光。


在脂質(zhì)體膜外表面共價(jià)連接量子點(diǎn)“熒光天線”的方法標(biāo)記免疫脂質(zhì)體。首先制備含有末端氨基修飾的PEG-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（NH2-PEG-DSPE）的阿霉素載藥脂質(zhì)體，然后選擇表面為羧基的水溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)作為熒光探針，HER2（人表皮生長(zhǎng)因子受體2）作為靶向修飾分子，分別和NH2-PEG-DSPE的氨基共價(jià)連接，形成量子點(diǎn)標(biāo)記免疫脂質(zhì)體（量子點(diǎn)ILs）（圖B）。共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞檢測(cè)均證實(shí)該量子點(diǎn)ILs對(duì)HER2過(guò)度表達(dá)的SK-BR-3和MCF-7/HER2細(xì)胞的靶向特性。腫瘤種植裸鼠靜脈給藥量子點(diǎn)ILs后，通過(guò)熒光成像系統(tǒng)觀察發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)主要分布在單核巨噬細(xì)胞T系統(tǒng)和腫瘤部位，T證實(shí)該載藥體系具有活體靶向治療作用。


⑵殼聚糖納米球


量子點(diǎn)熒光標(biāo)記殼聚糖納米藥物載體方向的研究。他們利用水溶性無(wú)機(jī)納米材料和殼聚糖之間的強(qiáng)靜電作用，成功制備了量子點(diǎn)-（Gd-DTPA）熒光-磁性雙功能標(biāo)記以及多色量子點(diǎn)標(biāo)記的殼聚糖納米球。近該小組制備了量子點(diǎn)標(biāo)記殼聚糖納米粒子作為HER2/neu siRNA的載體（圖C），并通過(guò)跟蹤量子點(diǎn)的熒光信號(hào)證實(shí)藥物載體靶向傳送到SKBR3乳腺腫瘤細(xì)胞，用熒光素酶和酶聯(lián)免疫分析驗(yàn)證導(dǎo)入細(xì)胞的siRNA的基因沉默效應(yīng)。這種量子點(diǎn)熒光示蹤的方法將有助于為今后開(kāi)發(fā)、篩選siRNA殼聚糖納米藥物載體，研究其體內(nèi)藥理特性。


⑶碳納米管


碳納米管（CNT）具有高純度和尺寸一致等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)人體毒性較小，在結(jié)構(gòu)上表面積 大，能攜帶大量藥物，并具有藥物緩釋特性，是諸多種類(lèi)納米藥物載體中的一支新秀。近來(lái)也有工作將CNT和量子點(diǎn)這兩種無(wú)機(jī)納米材料結(jié)合開(kāi)發(fā)納米藥物并應(yīng)用于活體研究。


首先用CdTe量子點(diǎn)共價(jià)標(biāo)記基因治療藥物反義寡核苷酸（ASODNs），并借助聚乙烯亞胺 （PEI）陽(yáng)離子聚合電解質(zhì)修飾羧基化的多壁碳納米管（MWNT），然后將ASODNs-量子點(diǎn)和功能化的MWNT以靜電作用方式結(jié)合，形成熒光標(biāo)記的碳納米管載藥系統(tǒng)（圖D）。實(shí)驗(yàn)通過(guò)共聚焦熒光成像等手段比較了PEI修飾前后MWNT對(duì)HeLa的細(xì)胞毒性和ASODNs輸送效率，發(fā)現(xiàn)羧基化MWNT在經(jīng)過(guò)聚合物修飾后毒性降低，而細(xì)胞核靶向傳送藥物的效率明顯提高。


采用直接用量子點(diǎn)標(biāo)記MWCNT的方法研究其在動(dòng)物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)分布行為。他們將外壁表面羧基化的MWCNT和表面氨基修飾、發(fā)射波長(zhǎng)為610 nm的CdSe/ZnS量子點(diǎn)偶聯(lián)生成MWCNTs-量子點(diǎn)納米藥物載體。將MWCNTs-量子點(diǎn)皮下注射至裸鼠背部和腹部，通過(guò)活體熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)。進(jìn)一步選擇發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng)的近紅外 CdSeTe/ZnS量子點(diǎn)，以相同的方式標(biāo)記MWCNT，并在空腔內(nèi)裝載抗腫瘤藥物紫杉醇（圖E）。將該復(fù)合體系通過(guò)尾靜脈注射至裸鼠體內(nèi)，經(jīng)過(guò)6天的循環(huán)代謝，近紅外活體 成像發(fā)現(xiàn)肝臟、腎臟、胃和小腸部位顯示明亮熒光，表明CNT納米藥物載體主要在這些臟 器分布蓄積，與通過(guò)ICP-MS測(cè)定組織內(nèi)鎘元素含量的結(jié)果相吻合。


3、       納米藥物釋放研究


   傳統(tǒng)考察納米藥物生物體內(nèi)釋放的方法主要是通過(guò)HPLC-MS等手段測(cè)定藥物的總含 量，在實(shí)際工作中這類(lèi)方法往往存在問(wèn)題。例如，難以對(duì)游離藥物和包封藥物分別定量；在生物體內(nèi)復(fù)雜背景下，對(duì)某些檢測(cè)響應(yīng)差或痕量藥物的定量也存在技術(shù)困難。前述的基于量子點(diǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（QDs-FRET）方法不僅在納米傳感器設(shè)計(jì)等領(lǐng)域得到了成功應(yīng)用，近來(lái)在納米藥物生物體釋放的研究中也取得一定的進(jìn)展。


   在基因納米藥物開(kāi)發(fā)中，多聚物-核酸復(fù)合物用于基因運(yùn)載的關(guān)鍵是在目標(biāo)細(xì)胞DNA能適時(shí)地從復(fù)合物中卸載，實(shí)現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)移。這一過(guò)程控速步驟的機(jī)理闡釋一直是一個(gè)難題。借助QDs-FRET方法對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行研究。將質(zhì)粒DNA（plasmidDNA）和殼聚糖基因載體分別標(biāo)記量子點(diǎn)和Cy5染料，組成FRET的供受體對(duì)。在復(fù)合物未解離時(shí)，量子點(diǎn)和Cy5的距離很近，二者可以進(jìn)行有效的FRET，造成Cy5熒光信號(hào)增強(qiáng)。 隨著復(fù)合物中DNA的釋放，量子點(diǎn)和Cy5間FRET現(xiàn)象消失，導(dǎo)致量子點(diǎn)熒光增強(qiáng)而Cy5信號(hào) 明顯下降（圖11）?；诹孔狱c(diǎn) FRET信號(hào)可以靈敏地檢測(cè)復(fù)合物穩(wěn)定性的變化；借助激光共聚焦顯微鏡便可以實(shí)時(shí)獲取復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)攝取和DNA解離釋放信息。 通過(guò)圖像定量分析發(fā)現(xiàn)在溶酶體、細(xì)胞漿及細(xì)胞核三區(qū)室質(zhì)粒DNA釋放符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。該課題組通過(guò)相同的手段又比較了殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚磷酸酯作為基因載體的解離動(dòng)力學(xué)，獲取結(jié)果與實(shí)際轉(zhuǎn)染效率得到了很好的吻合。用FRET手段分析不同相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖-質(zhì)粒DNA復(fù)合物的解離情況， 質(zhì)粒DNA和聚合物載體分別用量子點(diǎn)和德克薩斯紅染料標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著殼聚糖摩爾質(zhì)量增大，HEK29細(xì)胞中德克薩斯紅標(biāo)記殼聚糖的熒光逐漸下降，表明所形成復(fù)合物的解離程度更加明顯。另外用熒光光譜監(jiān)測(cè)復(fù)合物在pH 7.4和pH 5.0條件下熒光的變化情況，結(jié)果證實(shí)殼聚糖/DNA復(fù)合物的解離主要在酸性條件下發(fā)生。



雙FRET體系（Bi-FRETsystem）用于量子點(diǎn)裝載抗腫瘤藥物阿霉素（Dox）在細(xì)胞內(nèi)的釋放研究（圖12）。首先將量子點(diǎn)表面包覆可以識(shí)別特異性前列腺膜抗原的A10 RNA核酸適體（Apt），然后和阿霉素溶液混合，使阿霉素內(nèi)插至核酸適 體的雙鏈，形成[QDs-Apt（Dox）]復(fù)合物。藥物扦插作用形成量子點(diǎn)和阿霉素組成的供體-受體對(duì)以及阿霉素和核酸適體組成的供體-猝滅體對(duì)雙FRET體系，導(dǎo)致了復(fù)合物可逆性熒光自猝滅。復(fù)合物被前列腺腫瘤細(xì)胞識(shí)別和攝取后，隨著溫孵時(shí)間的延長(zhǎng)，阿霉素從復(fù)合物中釋放，細(xì)胞內(nèi)量子點(diǎn)和阿霉素的熒光信號(hào)均明顯上升，通過(guò)測(cè)定熒光信號(hào)變化，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞定位和細(xì)胞內(nèi)阿霉素釋放檢測(cè)。


應(yīng)該注意的是目前應(yīng)用量子點(diǎn)FRET方法研究藥物動(dòng)態(tài)釋放的工作都僅局限在細(xì)胞層次，活體動(dòng)物研究尚未見(jiàn)報(bào)道，主要原因是量子點(diǎn)近紅外活體成像的應(yīng)用還處于起步階段，諸如近紅外量子點(diǎn)體內(nèi)性質(zhì)和基于圖像信號(hào)的定量方法等問(wèn)題的研究還需要深入完善。相信隨著近紅外量子點(diǎn)和近紅外成像技術(shù)的發(fā)展和成熟，量子點(diǎn)FRET方法也必將在活體動(dòng)物體內(nèi)藥物釋放研究中發(fā)揮重要作用。


杭州新喬生物科技有限公司是國(guó)內(nèi)的的納米靶向試劑及材料供應(yīng)商，2017年我公司實(shí)驗(yàn)室新開(kāi)發(fā)上市熒光量子點(diǎn)系列產(chǎn)品（Fluorescent Quantum Dot），我們可以提供4種不同核殼型的熒光量子包括有：CdSe/ZnS硒化鎘-硫化鋅量子點(diǎn) ，CdS/ZnS硫化鎘-硫化鋅熒光量子點(diǎn)，InP/ZnS磷化銦-硫化鋅熒光量子點(diǎn)，ZnSe/ZnS硒化鋅-硫化鋅熒光量子點(diǎn)四種。同時(shí)我們還提供不同表面配體的核殼型熒光量子點(diǎn)產(chǎn)品包括有：十八胺、alkyl、油酸、氨基和羧基。我們的Fluorescentnanocrystals產(chǎn)品還包括脂溶性的和水溶性的，水溶性的是通過(guò)外圍包裹一層聚乙二醇PEG而實(shí)現(xiàn)水溶性的，表面可以修飾氨基和羧基。