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2-8℃ 避光

1.探針長期不用可以-20℃保存。避免反復(fù)凍融。
2.探針為DMSO溶液，冬季氣溫較低時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。
4.試劑拆封后請盡快使用完！

一年

熒光分光光度計或熒光酶標儀

植物組織

1.使用方便：可用熒光酶標儀、熒光分光光度計檢測；
2.背景低，靈敏度高；
3.線性范圍寬，使用方便。

1.熒光分光光度計或熒光酶標儀
2.勻漿機/勻漿器
3.離心機
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.PBS緩沖液
2.純水
3.蛋白定量試劑盒

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套
4.熒光檢測專用黑色96孔板

1.螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。
2.熒光探針為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室內(nèi)時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。
3.使用前，先將本品取出回溫至室溫（20℃以上），并對其進行簡短離心使DMSO溶液集中于管底。
4.盡量縮短探針標記后到測定所用的時間，以減少各種可能的誤差。
5.必須使用熒光檢測專用的黑色96孔板。

試劑準備：
根據(jù)樣本數(shù)量，用純水將O66探針10倍稀釋。充分混勻，備用。
【注】：
?不可以一次性將探針全部稀釋。
?現(xiàn)配現(xiàn)用。
?O66探針液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。
?微量操作時，注意探針要有效加入勻漿液，避免沒有加入。
?以下步驟使用的O66探針為此步驟稀釋過的探針。

樣本處理：
1.剛?cè)〉玫男迈r植物組織樣本用PBS洗凈。
2.準確稱取50 mg或100 mg植物組織樣本，加入500 μl-1 ml勻漿緩沖液A，用勻漿機/勻漿器充分勻漿。
3.在100×g，4℃離心5分鐘，取上清備用。

樣本檢測：
1.在96孔板中加入190微升勻漿上清液、10微升O66探針，用移液器吹打，使之充分混勻。
【注】：
?不同樣本的活性氧差異較大，需要根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果調(diào)整探針用量。一般加入2-10 μl探針，染色終濃度按試劑盒中探針母液的200-1000倍稀釋，200倍稀釋適合大多數(shù)樣本。
?如果熒光強度太強，超過了檢測儀器的量程，可以減少探針用量。保證所有樣本探針用量一致即可。
?以酶標儀檢測為例。也可以用熒光分光光度計檢測，根據(jù)所使用儀器決定勻漿液體積和染色容器。
2.在37℃避光孵育20-30分鐘。
3.置于酶標儀中，后于激發(fā)波長為506 nm、發(fā)射波長526 nm檢測熒光強度。
【注】：
?或使用熒光光度計等其它熒光檢測設(shè)備。
?必須使用熒光檢測專用的黑色96孔板。
?如果熒光強度太強，超過了儀器的檢測范圍，可以將孵育后的勻漿上清液稀釋后再檢測。一般稀釋5-50倍。

蛋白定量：
1.另取50微升上清勻漿液，用PBS大約稀釋30倍。
2.取100微升進行蛋白定量。

結(jié)果處理：
以熒光強度（RFU）/ 蛋白濃度（毫克蛋白）表示植物組織單線態(tài)氧強度。
【注】:
?數(shù)據(jù)與蛋白濃度的單位無關(guān)。
?此處以蛋白濃度數(shù)據(jù)作為校正系數(shù)，對不同樣品進行均一化處理。
?熒光強度強則單線態(tài)氧（1O2）含量高。
?可以用實驗中對照樣本的熒光強度值為基準，待測組樣本的熒光強度值占對照樣本的百分比來比較單線態(tài)氧（1O2）程度差異。