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人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞永生化

一、細(xì)胞基本屬性

細(xì)胞詳述

肝竇內(nèi)皮細(xì)胞是肝臟非實質(zhì)細(xì)胞中數(shù)目最多的細(xì)胞，約占肝非實質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的70%，在表型、功能上與普通毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有較大差異。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞之間缺乏細(xì)胞間連接，細(xì)胞下基底膜物質(zhì)很少，因此竇內(nèi)皮通透性較高，有利于調(diào)節(jié)物質(zhì)交換。

不同于肝細(xì)胞的自我復(fù)制，肝再生時新生LSECs主要來自肝內(nèi)外其他細(xì)胞成分的分化替代，不少研究證實了肝再生時LSECs的骨髓源性替代。內(nèi)皮祖細(xì)胞是參與這一過程的主要細(xì)胞成分。

窗孔是肝竇內(nèi)皮細(xì)胞具特征性的結(jié)構(gòu)，從＜10nm至1～2μm不等，生理條件下由于窗孔結(jié)構(gòu)的存在和缺乏內(nèi)皮下完整基膜的結(jié)構(gòu)，由肝竇內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的肝竇壁是全身毛細(xì)血管壁中缺乏基膜的毛細(xì)血管，除竇內(nèi)的血細(xì)胞外，血漿成分均能從窗孔進入Disse間隙，進行物質(zhì)交換。

該細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶TERT基因。

注意事項：  收到細(xì)胞后第一次傳代建議1：2傳代，充液培養(yǎng)基是維持培養(yǎng)基，不能用來培養(yǎng)細(xì)胞。

細(xì)胞特性

1) 細(xì)胞來源于人正常肝組織。

2) 細(xì)胞鑒定：血管假性血友病因子（vWF）免疫熒光染色為陽性。

3) 經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%。

4) 不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。

5) 細(xì)胞生長方式：上皮樣，多角形細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)。

實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機體中取出，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細(xì)胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞繁殖到一定系數(shù)后進行細(xì)胞鑒定。

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注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月。

2. 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，請注意保持無菌操作。

3. 傳代培養(yǎng)過程中，yi酶消化時間不宜過長，否則會影響細(xì)胞貼壁及其生長狀態(tài)。

4. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和技術(shù)部溝通；由于運輸?shù)脑?，個別敏感細(xì)胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，詳盡告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤、回訪直至問題得到解決。