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大鼠滑膜成纖維細胞

培養(yǎng)基：原代成纖維細胞培養(yǎng)體系

傳代特性：根據細胞特性

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣 ，95%；  CO2 ，  5%

細胞簡介：滑膜是關節(jié)囊的內層 ，淡紅色 ，平滑閃光 ，薄而柔潤 ，  由疏松結締組織組成。關 節(jié)腔內的所有結構 ，除關節(jié)軟骨、半月軟骨板以外,即便是通過關節(jié)腔的肌腱、韌 帶等均全部為滑膜所包裹。

滑膜分泌滑液 ，在關節(jié)活動中起重要作用。正?；し譃閮蓪?/span> ，即薄的細胞層(內 腔層)和血管層(內膜下層) ，是血管豐富的關節(jié)囊內膜 ，貼附于非關節(jié)面部分 ，覆 蓋于關節(jié)囊內的骨面上 ，不在軟骨面上 ，此部分稱為邊緣區(qū)或“裸區(qū)"?；こ?nbsp;粉紅色 ，光滑發(fā)亮、濕而潤滑 ，有時可見絨毛 ，  內含膠原性纖維。

滑膜細胞有A、  B兩型。  巨噬細胞樣A型細胞 ，表面有絲狀偽足、漿膜內陷、囊泡  、線粒體、溶酶體、胞漿纖維和高爾基體 ，具有吞噬功能；  B型成纖維樣滑膜細胞 (FLS) ，有高濃度的內質網結構 ，是介導 RA 關節(jié)破壞的主要細胞。
一、細胞基本屬性

原代細胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機體中取出，經胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞繁殖到一定系數后進行細胞鑒定。

實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。

五、大腦皮質放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

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注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月。

2. 在細胞培養(yǎng)過程中，請注意保持無菌操作。

3. 傳代培養(yǎng)過程中，yi酶消化時間不宜過長，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態(tài)。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和技術部溝通；由于運輸的原因，個別敏感細胞會出現不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯系，詳盡告知細胞的具體情況，以便我們的技術人員跟蹤、回訪直至問題得到解決。