豬流感病毒H3N2抗體Elisa試劑盒是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法(圖a)、用于檢測抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法

需要但未提供的材料及耗材
  1、酶標儀
2、精密移液器及一次性吸頭
3、蒸餾水
4、洗瓶或者自動洗板機
5、37℃水浴鍋或恒溫箱
6、500ml量筒
7、無粉一次性乳膠手套
 
【適用儀器】
  半自動的酶標儀，如Thermo MK3，或者國產(chǎn)酶標儀。
 
【樣本要求】
  樣本類型和采集
以下只是列出樣品采集的一般指南。所有樣本采集過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。
1、血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在- 20℃以下，避免反復凍融。
2、血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反復凍融。
 
樣本保存和穩(wěn)定性
樣本在2-8℃條件下，可以儲存72h，或者在- 20℃儲存6個月。樣本收集后，不是一次檢測完，請按一次用量分裝凍存，避免反復凍融，使用時在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。
豬流感病毒H3N2抗體Elisa試劑盒操作程序
1、所有試劑和組分都先恢復到室溫（平衡1小時），標準品、質(zhì)控品和樣品，建議做復孔。
2、按前面試劑準備中描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。
3、從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。
4、設置標準品孔、樣本孔和空白孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL，樣本孔加待測樣本50μL，空白孔不加。
5、除空白孔外，標準品孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100μL。
6、用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
7、揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置20s，甩去洗滌液，吸水紙上拍干。
8、如此重復4次（共洗板5次）。若使用自動洗板機，請按洗板機操作程序進行洗板，添加浸泡20s的程序，可以提高檢測的精度。洗板結束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應板。
9、將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。
10、所有孔加入終止液50μL，在酶標儀上讀取各孔吸光度（OD值）。
 
【檢驗結果的解釋】
檢測完成后，以標準品濃度做為縱坐標，對應的吸光度（OD值）作為橫坐標，利用計算機軟件，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl），創(chuàng)建標準曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。
如果樣品被稀釋，通過上述方法測的的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的zui終濃度。
【檢驗方法的局限性】
1、僅供科研使用，不得用于臨床診斷。
2、在試劑盒標示的有效期內(nèi)使用，過期產(chǎn)品不得使用。
3、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。
4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液。
5、如果樣本值高于zui高標準品濃度值，請將樣本適當稀釋后，再重新測定。
6、待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結果，檢測前，請排除該因素。
7、通過其他方法得到的檢測結果，與本試劑盒測定結果不具有直接的可比性。
【產(chǎn)品性能指標】
1、物理性能
試劑盒的各液體組分應澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應真空包裝，無破損漏氣。
2、劑量反應曲線線性
校準品劑量反應曲線相關系數(shù)r值，大于等于0.9900。
3、精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內(nèi)精度評估。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。批間變異系數(shù)CV%小于15%。
4、靈敏度
zui低檢出劑量小于1.0mIU/L。
5、回收率
三組已知的高、中、低濃度樣品，進行五次回收率評估，回收率在85%-115%之間。
6、特異性
本試劑盒識別天然和重組豬胰島素（INS），與結構類似物無交叉。
7、穩(wěn)定性

客戶須知:

1、液體類標本（細胞培養(yǎng)上清、組織勻漿、血清、血漿、尿液、胸水、腹水、腦脊液等）。
2、樣本保存：請盡早檢測，2-8℃保存一天；需更長時間須冷凍（-20℃或-70℃）保存。如需周期收集樣本，請將樣本及時分裝標號后，置-20℃或-70℃保存；
3、請?zhí)崆案嬖V我們：您樣本的種屬、樣本數(shù)量、待測指標及其他特殊要求。

購買承諾： 

1.有質(zhì)量問題免費包換，合同上注明了的.（質(zhì)量問題包括運輸不當，客戶在使用過程中測不出結果，等等?。?nbsp;
2.全程技術指導。（包括售前的標本收集，使用過程中不明白的地方，實驗結束后的數(shù)據(jù)分析，有任何疑問，我們技術都會即時給你去電） 
3.提供免費代測的服務。（你只需把標本寄過來，我們?yōu)槟愎?jié)省時間，幫你出結果，原始數(shù)據(jù)，分析數(shù)據(jù)均可提供，一般時間是5天左右） 
4.客戶有任何問題，我們都是在一個工作日之內(nèi)給出解決方案。售后和技術這一塊都是竭誠為客戶服務。

【儲存條件及有效期】
  1、2-8℃保存，切勿冷凍，有效期6個月。
  2、開封使用后，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中，密閉自封袋，并將全部試劑放回2-8℃冰箱。
  3、開封后，按照建議的條件保存，校準品、包被微孔板和HRP標記抗體，有效期為14天，其他成分在標簽標明的有效期內(nèi)是穩(wěn)定的。

常見問題分析
Q1.標曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色

溶解標準品以及倍比稀釋時，未渦旋震蕩或不夠充分。
標準品溶解、倍比稀釋時均需要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復吹打，效率較低、效果也不一定*。

 Q2.標曲和樣本均不顯色

在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導致顯色偏弱。
 推薦孵育階段，使用ELISA的微孔板振蕩器，調(diào)至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某個組分，如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手，一定要做好標記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。

 Q3.標曲顯色，樣本不顯色

當樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強，就無法檢測到。目前ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度zui高的方法，與不同技術結合后，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測靈敏度。
對于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測到樣本濃度，只能說可以提高樣本的可測率，并使結果更加可靠。因為通常用普通ELISA檢測的樣本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也更加可信。

 Q4.標曲和樣本都顯色，但復孔的CV大

這個問題就跟移液器和實驗者的操作有關了。移液器的使用維護不規(guī)范，就會造成移液的誤差較大；實驗者自身的操作習慣、加樣的*性對復孔的CV也有很大影響。
掌握移液器的正確使用和維護。關于個人的操作可練習移液動作、加快速度，確保移液的精密度。

Q5.本底偏高，樣本值測不到

標曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時候，本底過高會掩蓋目的信號，導致無法測到樣本值。
 在加入TMB顯色后，需實時觀察標曲顯色況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍色，即可終止反應。

 Q6.樣本經(jīng)不同梯度稀釋，計算得到的樣本值差異較大

有時候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應該如何稀釋，那么我們就會做下預實驗，確定稀釋倍數(shù)。然而有時候同一樣本做了幾個不同梯度稀釋后，計算得到的樣本值之間差異較大，應該選擇哪一個稀釋倍數(shù)呢？
 這里涉及到了基質(zhì)效應。通常血清樣本加樣量較高時，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸，基質(zhì)效應較明顯。而經(jīng)過稀釋后，干擾因素也隨之稀釋，影響就會較小。當某兩個梯度稀釋后，計算得到的樣本值接近時，我們就可以認為在該稀釋梯度時，樣本中的干擾因素影響較小，計算得到的值也是接近真實的。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言。對于濃度很低的樣本，經(jīng)過多倍稀釋后，就更加測不到了，此時可按照廠家說明書推薦的加樣方式操作。

 Q7.不同試劑盒中的組分能否通用

除非是公用的試劑如洗液、檢測緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，甚至是同一指標不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標準品、標準品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經(jīng)過優(yōu)化的，如果貿(mào)然使用其它試劑盒的組分，有可能對結果產(chǎn)生影響。