一站式生物素TUNEL試劑盒（FITC/POD）TUNEL 就是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的 dUTP 切口及末端標(biāo)記（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)，它是一種高靈、敏度、快速檢測細(xì)胞凋亡的方法。其原理是在發(fā)生凋亡細(xì)胞中會(huì)有大量的具有切口的DNA 片段、或具有游離 3’-OH 端、長度是 180-200 bp 倍數(shù)的 DNA 片段，
TdT (末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)可以以不依賴模板的方式進(jìn)行標(biāo)記，如參入熒
光素、生物素或等標(biāo)記的 dUTP，而正常細(xì)胞 DNA 幾乎沒有游離的 3’
-OH 和切口，所以通過對(duì)標(biāo)記物的顯色反應(yīng)和熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測
就可以區(qū)分正常和凋亡的細(xì)胞。此過程的示意圖如下：
DNA 末端標(biāo)記 DNA 切口標(biāo)記
一站式生物素TUNEL試劑盒（FITC/POD）有如下特點(diǎn)：
1. 一站式，不需要額外準(zhǔn)備的試劑（但客戶還是需要自備常規(guī)的試劑，
如水、PBS 和細(xì)胞涂片所需試劑）。
2. 高靈敏度，可以在單細(xì)胞水平檢測到細(xì)胞凋亡，適合檢測早期的細(xì)胞凋亡。
3. 特異性高，只標(biāo)記凋亡細(xì)胞，而不標(biāo)記壞死細(xì)胞。
4. 快速，整個(gè)操作過程僅需 1-2 個(gè)小時(shí)即可完成。
5. 方便，一步染色反應(yīng)，洗滌后即可觀察，不必使用二抗等進(jìn)行多步操作。
6. 適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片），
足夠處理十張切片使用。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 10 次塑料袋包裝
1×TdT Buffer 81206A 0.5 mL
TdT 酶（20 U/uL） 81206B 10 uL
Proteinase K 溶液（200 ug/mL） 81206C 1 mL
Streptavidin-HRP 81206D 50 uL
DAB 干粉 81206E 1 mg
使用手冊 81026sc 1 份
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年
自備試劑 二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2、Triton X-100、檸檬酸鈉、蘇木素染液、
超純水。
使用方法 一：樣本預(yù)處理（操作步驟僅供參考，本試劑盒不提供相關(guān)試劑）
下面所用的固定液、淬滅液和通透液均需要新鮮配制。固定液是溶于 pH
7.4 的 PBS 中的、濃度為 4%的多聚甲醛溶液；淬滅液是用甲醇將 H2O2原
液（30%）稀釋到 3%而得；通透液是溶于 0.1%檸檬酸鈉中的、濃度為 0.1%
的 Triton X-100 溶液。
對(duì)貼壁細(xì)胞或細(xì)胞涂片
1. 將自然晾干的貼壁細(xì)胞或細(xì)胞涂片浸入固定液中室溫固定 30-60 分鐘。
為改善細(xì)胞的滲透性，可將固定好的樣本放在 70%乙醇中-20℃放置過
夜。為防止樣本脫落，可使用硅烷處理的載玻片或采用多聚賴氨酸鋪片。
2. 用自備的 PBS 漂洗 2 次，每次 5 分鐘。
3. 浸入淬滅液中室溫放置 10 分鐘后，用 PBS 漂洗 2 次，每次 5 分鐘。
4. 浸入通透液中，冰上放置 2 分鐘后，用 PBS 漂洗 2 次，每次 5 分鐘。
用吸水紙吸干樣本周圍水分。待用。
對(duì)石蠟組織切片
1. 將切片置于染缸中，用二甲苯脫蠟 2 次，每次 5 分鐘；再分別用 100%、
95%、90%、80%、70%的乙醇和 PBS 各洗一次，每次 3 分鐘。
2. 在每張切片上滴加 100 uL 蛋白酶 K工作液(10 uL 蛋白酶 K 溶液+90 uL
PBS 緩沖液)并在室溫放置 15-30 分鐘以降解交聯(lián)的蛋白和其他內(nèi)源蛋
白。注意：蛋白酶 K 工作液的用量和處理時(shí)間一般都需根據(jù)樣品的不同
而單獨(dú)進(jìn)行優(yōu)化，此處的用量只供參考。蛋白酶 K 處理后不需要再淬滅
內(nèi)源蛋白酶。
3. 用 PBS 漂洗 4 次，每次 3 分鐘。此步不能省略，否則殘留的蛋白酶 K 將
會(huì)降解后面降壓加入的 TdT。用吸水紙吸干樣本周圍水分。待用。
對(duì)冰凍切片
1. 將切片在固定液中室溫固定 20-60 分鐘，PBS 洗滌 2 次，每次 10 分鐘。
2. 浸入淬滅液中室溫放置 10 分鐘后，用 PBS 漂洗兩次，每次 5 分鐘。
3. 浸入通透液中冰上放置 2 分鐘后，用 PBS 漂洗兩次，每次 5 分鐘。用吸
水紙吸干樣本周圍水分。待用。
陽性對(duì)照樣本
1. 所有處理步驟跟樣品一樣，只是在zui后還需在樣品上滴加 100 μL 自備的
DNase I 反應(yīng)液室溫放置 10-30 分鐘。反應(yīng)液含 40 mM Tris-HCl pH
7.9，10 mM NaCl，6mM MgCl2，10mM CaCl2和不同濃度的 DNase
I（冷凍切片需 3U/mL、石蠟切片需 1500 U/mL、一般樣本需 10
U/mL）。用 PBS 洗兩次，每次 5 分鐘。用吸水紙吸干周圍水分后待用。
二．標(biāo)記和顯色反應(yīng)
2. 配制所需量的 TdT 酶反應(yīng)液：將 1 uL TdT 酶加入到 50 uL 1×TdT
Buffer 中即可。TdT 酶反應(yīng)液需即用即配，不宜保存，否則酶會(huì)失活。
3. 在除陰性對(duì)照外的每個(gè)樣本上滴加 50 uL TdT 酶反應(yīng)液，加蓋玻片后
37℃避光放置 60 分鐘。注意：加蓋玻片可使反應(yīng)液均勻分布，并避免其
揮發(fā)。陰性對(duì)照只滴加 50 uL 不含 TdT 酶的反應(yīng)液。
4. 用自備的 PBS 清洗 3 次，每次 5 分鐘，用吸水紙吸干樣本周圍殘留液體。
5. 將 5 uL Streptavidin-HRP 溶液加入 45 uL PBS 中，混勻后全部加在
切片上并加蓋玻片，37℃避光放置 30 分鐘。
6. 用自備的 PBS 清洗 4 次，每次 5 分鐘，用吸水紙吸干樣本周圍殘留液體。
7. 滴加 50 uL 新鮮配制的 DAB 工作液（將1 mg DAB干粉溶于 1 mL PBS
中，取 50uL 與 1 uL 30% H2O2混合即得 DAB 工作液，剩余的 DAB
溶液可-20℃避光保存），室溫顯色 10 分鐘。
8. PBS 漂洗 4 次，前 3 次每次 1 分鐘，zui后 1 次 5 分鐘。
9. 光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。亦可用蘇木素或甲基綠復(fù)染復(fù)染后再觀察。
問題及解答 現(xiàn)象 可能原因 建議
非特異性
染色
Biotin-dUTP 非特異性結(jié)合 勿使細(xì)胞干涸
TdT 酶的濃度過高 將 TdT 酶稀釋 1-10 倍
內(nèi)源過氧化物酶未被淬滅 用淬滅液室溫淬滅 10 分鐘
內(nèi)源核酸酶或聚合酶活性高 取樣后立即固定
染色背景
較高
內(nèi)源過氧化物酶未被淬滅 用淬滅液室溫淬滅 10 分鐘
樣本被支原體污染 制備未被污染的新樣本
標(biāo)記反應(yīng)過強(qiáng) 將 TdT 酶稀釋 2-5 倍
細(xì)胞處于高度增殖期 在非高增殖期取樣檢測
DAB 孵育時(shí)間過長 減少 DAB 染色時(shí)間
標(biāo)記率 固定劑（乙醇或甲醇）效果差 改用多聚甲醛或戊二醛
低、染色
淡至無
固定時(shí)間過長導(dǎo)致過度交聯(lián) 縮短固定時(shí)間
促滲條件不佳 增加通透劑促滲時(shí)間