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小腦顆粒神經(jīng)元的原代培養(yǎng)實驗
閱讀：223 發(fā)布時間：2018-12-14實驗方法原理 小腦顆粒神經(jīng)元的體外培養(yǎng)受取材部位、特殊培養(yǎng)條件等因素的影響，易于獲得純度較高的培養(yǎng)物。該細胞為雙極突起，常用來研究神經(jīng)突起的生長。其培養(yǎng)條件具有高濃度鉀離子依賴特性，常用來作為誘導神經(jīng)元凋亡的研究模型。當成熟顆粒神經(jīng)元的培養(yǎng)液由高KCl(通常是25-30mmol/L)換為低KC!(基本培養(yǎng)液中已含5mmol/L KCl)時，細胞會逐漸發(fā)生凋亡。
實驗材料 新生7d的SD大鼠仔鼠
試劑、試劑盒 10%胎牛血清+DMEMNeurobasal+B27KCl
儀器、耗材 培養(yǎng)瓶
實驗步驟
原代培養(yǎng)來自于新生7d的SD大鼠小腦顆粒神經(jīng)元，可參考Moreno-Flores的方法，此方法培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元純度達到95%以上。具體操作過程如下。
1.首先依照總論的方法獲得細胞懸液，然后在離心獲得的細胞沉淀中，加入少量的*培養(yǎng)液(Neurobasal+B27+25mmol/L KCl)重懸細胞，再根據(jù)細胞計數(shù)的結果補加適的*培養(yǎng)液。根據(jù)培養(yǎng)目的按照合適的密度接種細胞于多聚賴氨酸包被的介質上，37℃,5%CO2的孵育箱內培養(yǎng)。
2.細胞培養(yǎng)第4天1/2量換液，至第7天細胞基本成熟。小腦顆粒神經(jīng)元胞體小，接種后約24h,開始伸出突起，突起易成束生長。圖I-2示接種48h后細胞生長情況。
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注意事項
1.在原代取材時，由于取材部位和仔鼠體積的原因，通常將消過毒的仔鼠放置在100mm玻璃皿中，直接用解剖器械取出完整的小腦，不做斷頭處理。
2.小腦的腦膜不易剝離干凈，要特別仔細去除，否則培養(yǎng)物中成纖維細胞的污染難以去除。
3.由于培養(yǎng)細胞的目的不同，接種時的密度就有區(qū)別。如用于神經(jīng)突起觀察，可接種(1-3)x105/cm2的密度；如用于凋亡誘導的研究，可接種(4-6)x105/cm2的密度。
4.在做凋亡誘導時，通常將含高鉀的培養(yǎng)液全量換液為不含額外添加KCl的普通Neurobasal+B27培養(yǎng)液即可。按照核固縮判斷的方法，8h后凋亡的細胞數(shù)量可達40%左右。
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其他
1小腦顆粒神經(jīng)元胞體小，突起細長，且容易成束生長，個人感覺該細胞可做突起生長的大致觀察，并不適合利用軟件分析突起長短。神經(jīng)元一般3-4d突起就可長好，可開始觀察。
2.在體外培養(yǎng)7d左右待細胞成熟后，可以開展凋亡實驗。如添加保護劑抑制凋亡，應注意誘導凋亡的時間不可過長，否則可能導致保護實驗失敗。