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工欲善其事，必先利其器 ——基因篩選與蛋白檢測
閱讀：255 發(fā)布時間：2018-11-29基因篩選與蛋白檢測是近年來備受矚目的創(chuàng)新前沿技術，在探索疾病相關基因及其表達的蛋白在特定生理、病理、發(fā)育等過程中所起的功能時發(fā)揮重要作用，正成為診斷與治療血液病、腫瘤、遺傳病等疾病的有利工具。
Sanger矩陣型CRISPR文庫——讓基因篩選更
2012年，基因編輯技術CRISPR橫空出世，以其簡易、的特征迅速成為該領域的新寵。CRISPR技術以引導RNA（gRNA）識別靶序列，以單個蛋白Cas9切斷DNA雙鏈，終實現(xiàn)基因的*沉默。基于這一的特征，CRISPRZhang Feng團隊等迅速將其應用于全基因功能*沉默的篩選。經(jīng)過幾年的高速發(fā)展，基于CRISPR的全基因篩選有效減少篩選中的脫靶現(xiàn)象，避免關鍵基因的遺漏，已隱隱有超越shRNA模式的態(tài)勢。初，科學家使用的是集合型文庫，集合型全基因文庫的出現(xiàn)，幫助人們實現(xiàn)了對全基因水平的功能*缺失的篩選?？茖W家們利用CRISPR/Cas9集合型文庫篩選發(fā)現(xiàn)黑色素瘤耐藥關鍵基因1，實現(xiàn)腫瘤生長與遷移的在體篩選2，甚至發(fā)現(xiàn)病毒感染人類的關鍵基因3。
2016年科技界創(chuàng)新"奧斯卡獎"R&D 100大獎授予了Sanger矩陣型CRISPR文庫。由Merck公司與Sanger研究所聯(lián)合推出的這款CRISPR矩陣型文庫，突破"篩選方式限于細胞分群實驗、依賴低MOI慢病毒介導、數(shù)據(jù)分析必須通過二代測序"等CRISPR集合型文庫的局限性，為科學家們帶來了技術革新的福音：篩選策略不再受限于正向或反向篩選，而是可以使用各類細胞學實驗作為數(shù)據(jù)讀出結果?？茖W家們爭先鞏后利用CRISPR/Cas9矩陣型文庫實現(xiàn)功能基因的大規(guī)模敲除4，構建GPI調(diào)控蛋白的全基因篩選模型5，大大加速了科學研究發(fā)現(xiàn)流程。
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看得見的蛋白互作新技術Duolink® PLA®——讓蛋白檢測更
腫瘤、高血壓、糖尿病，人類面臨著與疾病賽跑的巨大壓力。如何利用蛋白生物標志物加速對疾病致病機理的探究過程，診斷有效預后是科學家與醫(yī)學工作者們研究的重點與難點。傳統(tǒng)的蛋白研究方法如Co-IP、Western blot、ELISA、IF等因檢測靈敏度低、假陽性高、適用樣本范圍窄等原因而呈現(xiàn)出極大的局限性。
看得見的蛋白互作新技術Duolink® PLA® 的出現(xiàn)給科研工作者帶來更大的可能性。Duolink® PLA®可實現(xiàn)單分子級別的蛋白互作檢測，特異性放大信號1000倍，實現(xiàn)了可視化原位定量檢測細胞生理水平的微量蛋白的微弱互作和修飾。目前，Duolink® PLA® 技術已在腫瘤學、神經(jīng)生物學、免疫學、病毒學、表觀遺傳學、生殖發(fā)育、組織病理學、心血管、代謝等研究領域進行了廣泛報道。
應用1：Duolink® PLA®在微量細胞中的微弱蛋白互作檢測，解決Co-IP技術無法實現(xiàn)的應用
在神經(jīng)生物學研究中，很多時候研究的起始材料包括細胞、組織等非常微量，同時相互作用的蛋白也很微弱，超出了傳統(tǒng)方法如CO-IP的檢測靈敏度。在神經(jīng)生物學研究中，DYX1C1是閱讀障礙的易感基因，與神經(jīng)元遷移有關，但是并不清楚它們之間的功能與相關性。
下圖顯示原代大鼠胚胎海馬神經(jīng)元使用雌二醇培養(yǎng)48h，PLA檢測雌激素受體ERs/DYX1C1在神經(jīng)突觸中的相互作用（A和D為雌二醇（E2）刺激組，B和E為未刺激組，C和F為無抗體陰性對照），每一個紅點代表ERs/DYX1C1相互作用的復合物，藍色代表 Hoechst染細胞核，綠色代表Actin蛋白。作者使用傳統(tǒng)Co-IP方法并沒有在胚胎神經(jīng)元中檢測到相互作用的復合物。通過PLA技術，對DYX1C1的功能有新的理解，發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元遷移，閱讀障礙與雌性激素信號通路的聯(lián)系，從而影響腦發(fā)育，調(diào)節(jié)認知功能。
應用2：Duolink® PLA®在病理組織中蛋白相互作用的原位檢測，解決IHC無法實現(xiàn)的應用
在腫瘤的靶向治療過程中，BRAF是非常重要的藥物靶點，很多腫瘤都存在BRAF(V600)的突變，很多藥物都是針對這個位點，但是逐漸增加的藥物抗性讓大家迫切希望能夠進一步發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標，和傳統(tǒng)藥物聯(lián)合治療，進一步提高藥物治療效果。
下圖是發(fā)表在Nature上的文章，研究者從藥物產(chǎn)生抗性的機理出發(fā)，針對抗性相關的信號通路中共同的復合物eIF4F，開發(fā)了Duolink® PLA®原位技術在細胞以及臨床病人的病理組織樣本進行大量的檢測的方法。圖中顯示與anti-BRAF治療前的腫瘤相比，eIF4F復合物的形成比率在免疫應答的腫瘤中降低，在抗藥性轉(zhuǎn)移的腫瘤中復合物形成比率升高，圖中每個棕色的點狀信號代表一個相互作用復合體。因此eIF4F能夠作為先天（innate）和獲得性（acquired）抗性的指示器，也能作為抗腫瘤治療的靶標。通過封閉eIF4E–eIF4G相互作用或靶向eIF4A，能夠抑制eIF4F復合物的形成，從而協(xié)同抑制BRAF(V600)，消除腫瘤細胞。
PLA技術作為病理組織學研究的第二代新技術，在蛋白相互作用研究中具有高分辨率及性，是傳統(tǒng)IHC實驗無法實現(xiàn)的，能夠建立高質(zhì)量建立病樣組織標本庫。
應用3．Duolink® PLA®在單細胞水平分析組蛋白的修飾，解決ChIP研究中無法實現(xiàn)結果的應用
表觀遺傳學是當前眾多研究中非常熱點的方向，而ChIP又是表觀遺傳學中重要的技術之一，能很好地理解組蛋白修飾在基因調(diào)控中的作用，但ChIP無法在單細胞水平上進行研究。
下圖發(fā)表在Nature上的文章，將PLA技術與原位雜交（ISH）技術聯(lián)合起來開發(fā)出新的ISH-PLA技術，能夠在石蠟切片的組織樣本中，對特定類型單細胞中的特定基因位點的組蛋白修飾進行可視化研究，圖中箭頭表示在人頸動脈和腦組織中的組蛋白修飾的PLA信號。研究發(fā)現(xiàn)在人和小鼠的組織中MYH11位點的H3K4me2被限制在平滑肌細胞中，ISH-PLA 能夠準確、特異性地檢測人和小鼠組織中單個細胞的特定基因位點的組蛋白修飾。該研究次在復雜的多種類型細胞存在的完整組織樣本中，在內(nèi)源性水平鑒定了特定細胞和基因位點組蛋白修飾，顯示在體內(nèi)SMC細胞中MYH11基因H3K4me2*和重要的表觀特征，表明PLA技術可以很方便地適用于單細胞水平組蛋白修飾和多個基因位點的檢測。
1. Ophir Shalem, Neville E. Sanjana, Ella Hartenian et al. Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Science. 2014 January 3; 343(6166): 84–87.
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3. Rong Zhang, Jonathan J. Miner, et al., A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 2016 July 7; 535(7610): 164–168.
4. Tobias Schmidt, Jonathan L. Schmid-Burgk & Veit Hornung, Synthesis of an arrayed sgRNA library targeting the human genome. DOI: 10.1038/srep14987.
5. Unpublished data provided by courtesy of Emmanouil Metzakopian, Wellcome Trust Sanger Institute.
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9. Mellberg S, Dimberg A, Bahram F, et al. Transcriptional profiling reveals a critical role for tyrosine phosphatase VE-PTP in regulation of VEGFR2 activity and endothelial cell morphogenesis[J]. Faseb Journal, 2009, 23(5):1490-1502.
10. Gomez D, Shankman L S, Nguyen A T, et al. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections[J]. Nature Methods, 2013, 10(2):171.
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